化學鍵合相用於哪些LC中

㈠ 高效液相色譜中固定相分類最常用的是哪類

高效液相色譜柱大致可分為五類:一、高效反相液相色譜柱 以C18為代表的高效反相液相色譜柱一直被描述為葯物發現、開發、方法驗證(validation)的心臟! 高效反相液相色譜柱也極其廣泛應用在葯物代謝及動力學、生命科學、醫療健康、生物分析檢測、毒品和興奮劑檢測、食品安全分析、環境分析、軍事、國土安全等領域! 高效反相液相色譜制備柱也是最重要的分離純化技術之一! 無論是過去，現在和可預見的未來, 以球形B型硅膠(5um 或 3um)為材料骨架的高效反相液相色譜柱在實際應用中永遠佔有統治地位!常規HPLC方法的開發幾乎總是從C18作為出發點，反相色譜佔了80%以上的應用。 過去數十年來, 無數努力集注於: 1) 改善硅膠的品質, 優化鍵合化學; 2)開發新穎的材料骨架替代硅膠。十多年前, 使用有機硅材料取代無機硅材料作為起始原料生產球形硅膠代表一個劃時代的革命! 生產的球形硅膠命名為B型球形硅膠。無機A型硅膠重金屬含量很高, 硅膠表面若干位置嚴重酸化及螯合效應等導致許多鹼性化合物回收率低。球形B型硅膠重金屬含量很低, 在非常大的程度上消除了A型無機硅膠表面若干位置嚴重酸化及螯合效應等問題。用B型球形硅膠合成高效液相色譜填料, 導致高效液相色譜柱產品質量有質的飛躍!然而，另一方面，基於客戶的大量反饋和我們對幾乎所有色譜廠商產品的評估, 我們相信鍵合化學問題沒有獲得很好的解決。具體體現在:
(1) 「純粹」反相機理的鍵合相例如C18和C8市場上仍然是單功能，三功能和聚合物鍵合相"魚目混雜"。 (2) 鍵合相封端問題沒有獲得很好的解決, 一直是困擾色譜領域最大的問題! 迄今為止全部的嘗試只獲得有限的成功。
(3) 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相是C18高效反相液相色譜"衛星群"中最重要的產品, 是C18和C8鍵合相最重要的補充。
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相起源於Supelco ABZ。Supelco ABZ的鍵合方法是用aminopropyl鍵合相和長鏈羧酸縮合反應形成一個C16醯胺。 那麼市場上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群的主要問題是什麼? 極性嵌入式鍵合相和所謂的水相C18主要問題是鍵合相泄漏, 鍵合相不穩定等。兩者之間的內在差異是: 極性嵌入式鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩定等問題能夠獲得很好的解決, 但使用極性硅烷試劑封端的所謂的水相C18鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩定等問題是不可逆轉的。 在類似C18鏈長度的硅烷試劑中嵌入極性醯胺或醯酯, 使得鍵合相親水, 在100%水相條件下穩定。但按照類似C18的鍵合化學, 鍵合覆蓋率低, 鍵合相不穩定。 Chrom-Matrix InnovationTM PEG鍵合相是非常極性的產品, 但測試結果表明: PEG鍵合相非常穩定, 在LC-MS測試中沒有檢測到泄漏。這一成功和我們在膠體與界面科學領域的長期經驗幫助我們成功開發了新型催化條件下新的鍵合化學。加上超臨界流體技術封端, Chrom-Matrix InnovationTM 極性醯胺或醯酯鍵合相比那麼市場上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群穩定得多。色譜柱產品質量和壽命有質的飛躍! 即使這樣, LC-MS測試顯示: Chrom-Matrix InnovationTM 極性醯胺或醯酯鍵合相仍然有非常低的泄漏。(4) 無泄漏低孔和高比表面積C18鍵合相等是小分子化合物分離純化的終端保證!制備型高效反相液相色譜柱, 制備型高效正相液相色譜柱, 制備型高效離子交換色譜柱和對應的閃光色譜(flash chromatograpy) 是小分子化合物分離純化最重要的終端保證!但是市場上大多數色譜產品和閃光色譜(flash chromatograpy)鍵合相有明顯的泄漏。盡管泄漏在紫外可見檢測器中是看不見的, LC-MS信號非常明顯! 最重要的是泄漏的硅烷實實在在洗脫到顧客的終端純化產品中, 而且沒有考慮在內。

Chrom-Matrix公司成功地解決了上述所有問題! InnovationTM所有反相高效液相色譜產品都使用B型球形硅膠合成, 使用最優化個性化合成工藝, 使用超臨界流體封端, 使用LC-MS/MS和表面電荷滴定等多種獨特技術配合多種色譜測試保證產品的品質和批次重現性。其中大部分產品LC-MS/MS測試無泄漏, 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相非常低的泄漏。二、高效正相液相色譜柱 正相液相色譜是最早的色譜模式。直到現在, 合成後通過硅膠柱做進一步純化仍然是有機化學家日常工作的一個重要組成部分。在理論上, 幾乎所有的溶於正己烷，乙酸乙酯或異丙醇的有機化合物都可以用高效正相液相色譜分析。但在實際應用中，高效正相液相色譜的應用比高效反相色譜少得多。這是因為正己烷, 乙酸乙酯沒有像水，甲醇或乙腈那樣受歡迎。此外, A型硅膠正相液相色譜給客戶一個慣性思維: 高效正相液相色譜的平衡時間很長。事實上, 高效正相液相色譜在制備規模的色譜純化中一直發揮了重要作用。這是因為:(1) 高效正相液相色譜比高效反相色譜柱壓低得多。(2) 高效正相液相色譜用的溶劑例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通過旋轉蒸發除去。(3) 吡咯等蒸發性溶劑徹底改善了鹼性有機化合物在B型球形硅膠, Diol和PEG正相液相色譜柱上的峰形。此外, 不管制備規模或分析測試,(1) 結構異構體分離分析必須使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。(2) 環境中腐殖酸的結構鑒定必須使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然後使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。這種小分子聚集的自然現象一定相當廣泛。PEG正相液相色譜鍵合相等將讓客戶重新評估高效正相液相色譜的價值。三、高效親水液相色譜柱 高效親水液相色譜是一個介於正相和反相高效液相色譜之間的運作模式。這個模式最早來自NH2色譜柱的糖分析應用。在此之後，逐步在Diol, 硅膠和親水性高分子鍵合相找到了一些有價值的應用。近年來，高效親水液相色譜成為比較流行的色譜的運作模式, 主要是因為親水性化合物有良好的保留和高效親水液相色譜在LC-MS/MS中的應用。盡管如此，迄今為止沒有權威的論文, 評論和教科書揭示了高效親水液相色譜真正的價值和局限性。近年來，我們幫助客戶採用高效親水液相色譜的運作模式成功地開發和驗證了數以百計的HPLC和LC-MS/MS應用。我們總結出:(1) 高效親水液相色譜是LC-MS/MS應用的第一選擇。請參閱我們的LC-MS/MS產品手冊應用案例。(2) 除了InnovationTM TX多功能色譜柱, 所有親水液相色譜僅可用於分析，而不是制備規模的分離。(3) 高效親水液相色譜流動相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他調節), 流動相B是水(pH值用少量的甲酸或其他調節)。化合物洗脫秩序類似於正相液相色譜, 疏水性化合物首先洗脫, 然後是親水化合物。流動相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有機溶劑。(4) 進樣體積太大會導致一些峰值扭曲或分裂。柱承載能力通常是非常小的。(5) InnovationTM TX, HP Amide, Silica三種高效親水液相色譜覆蓋99 ％以上的應用, NH2色譜柱用於簡單糖分析應用。(6) 除了InnovationTM TX多功能色譜柱, 所有親水高效液相色譜柱柱效不如正相和反相高效液相色譜。四、高效強陽離子交換液相色譜柱 離子交換液相色譜是生物分離最常見最有用的一種色譜模式。另一方面，小分子分離分析極少使用高效離子交換液相色譜。這是因為:(1) 新穎的反相和多功能鍵合相例如InnovationTM Polar-Embedded Stable Amide和TX連續出現, 在很大的程度上補償了常規C18鍵合相的缺點。 C18, C8鍵合相也有重大進展。高效親水液相色譜柱也覆蓋了許多分析應用。(2) 相比之下, 硅膠基質的高效離子交換鍵合相近幾十年來產品質量沒有取得質的突破。硅膠基質的高效離子交換鍵合相柱壽命普遍短, 疏水相互作用明顯。(3) 聚合物基質的高效離子交換鍵合相在生物分析上面的應用比較廣泛, 但其柱效過低，表面積太小，對小分子分離分析難有吸引力。 科學發明往往來自現實世界的挑戰! 在對海洋毒素, 微生物代謝產物和天然植物(包括中草葯)有效成分的分離純化過程中, 我們深深感到高質量的硅膠基質的高效離子交換鍵合相是必不可少的! 因此，我們開發了硅膠基質的SCX, WCX, DEAE和SAX高效離子交換鍵合相。五、InnovationTM高效多功能液相色譜柱我們介紹四種高效多功能液相色譜柱:(1) InnovationTMTX毒品分析HPLC柱 InnovationTM TX毒品分析HPLC柱是實際應用中最有價值的一種色譜柱。由於其在毒品分析上出色的表現, DEA專家稱它毒品分析HPLC柱。InnovationTM TX是一個多功能色譜柱, 具有反相, 弱陽離子離子交換, 親水等作用, 能夠使用在100%水相或100%有機相。由於它的弱陽離子離子交換機理, InnovationTM TX對鹼性化合物的分離效果是所有色譜柱中最好的。它對鹼性化合物有完美的峰形。它的絕對柱效和反相色譜分析柱相同的，甚至優於反相, 遠勝傳統的親水色譜分析柱。(2) InnovationTM DNPH HPLC柱 InnovationTM DNPH HPLC柱主要用於環境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析應用中, 任何其他色譜柱沒有它優越的選擇性。(3) InnovationTM PAH HPLC柱 (4) 血漿，血清直接進樣的InnovationTM PEG色譜柱 限制進入鍵合相(Restricted access media)最早由Merck公司發明。一個典型的方法是首先製造Diol鍵合相, 然後通過醯酯或醯胺反應嵌入疏水鏈。硅膠外表面的醯酯或醯胺鏈使用酶切斷開。但酶不能擴散到內表面。由此外表面親水, 內表面疏水。血漿，血清, 尿樣可以直接進樣。蛋白質等生物流體通過親水外表面時沒有保留, 小分子化合物可以擴散到內表面通過反相保留最後洗脫。限制進入鍵合相(Restricted access media)在學術領域比較歡迎, 但隨著固相萃取產品的發展, 在工業領域的應用相當少。 但我們最後發現, 血漿，血清, 尿樣可以直接進樣的限制進入鍵合(Restricted access media), 尤其是InnovationTM PEG色譜柱在葯物代謝領域具有獨特價值。葯物代謝研究, 尤其是全盲條件下的早期葯物代謝研究, 追求絕對回收率! 一種葯物代謝之後, 打破成許多小分子化合物。全盲條件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代謝產物。最理想的方法是, 血漿，血清, 尿樣可以直接進樣, 每毫升收集液使用14C同位素檢測, 然後建立一個明確的代謝概況。 InnovationTM PEG色譜柱是一種多功能色譜柱。它是最好的正相色譜柱! 同時，使用乙醇取代儲存溶劑後, 它能夠被用來作為反相讓血漿，血清, 尿樣可以直接進樣。

㈡ 什麼是色譜的鍵合固定相

化學鍵合相色譜採用的是硅膠作為載體，然後通過烷基化，硅烷基化等，形成Si-O-R/Si-R/Si-O-SiR3等鏈，附在載體的表面，提高了固定相與流動相之間的相互作用力。根據極性的不同又可以分為正相色譜（固定相極性大）和反相色譜（流動相極性大）。
機械塗布固定液是將固定液直接塗布在載體（如玻璃微粒）表面，依靠的是固定液的浸潤性等因素，而與化學鍵的作用力無關。

㈢ 什麼是正相鍵合相色譜法什麼是反相鍵合相色譜法

正相鍵合相色譜法
1. 氰基與氨基化學鍵合相
是正相鍵合色譜法較常用的固定相。流動相與以硅膠為固定相的吸附色譜法的流動相相似，也是烷烴（常用正已烷等）加適量極性調整劑而構成。氰基鍵合相的分離選擇性與硅膠相似，但極性小於硅膠，即用相同的流動相及其它條件相同時，同一組分的保留時間將小於硅膠。許多需用硅膠柱分離的課題，可用氰基鍵合相柱完成。氨基鍵合相與硅膠的性質有較大差異，前者為鹼性；後者為酸性。在作正相洗脫時，表現出不同的選擇性。氨基鍵合相色譜柱是分析糖類最重要的色譜柱，也稱為碳水化合物柱。
2. 分離機制
主要靠范德華作用力的定向作用力、誘導作用力或氫鍵作用力。例如，用氨基鍵合相分離極性化合物時，主要靠被分離組分的分子與鍵合相的氫鍵作用力的強弱差別而分離，如對糖類的分離等。若分離含有芳環等可誘導極化的非極性樣品，則鍵合相與組分分子間的作用力，主要是誘導作用力。
3. 流動性的極性與容量因子的關系
在作正相洗脫時，流動相的極性增大，洗脫能力增加，K減小，t減小；反之k與t增大。分離結構相近的組分時，極性大的組分後出柱。

反相鍵合相色譜法
典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（ODS或C）鍵合相；流動相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色譜系統，用弱極性或中等極性的鍵合相和極性大於固定相的流動相組成。
(1) 分離機制 反相鍵合相表面具有非極性烷基官能團，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩餘硅醇基的多寡，視覆蓋率而定。簡要介紹疏溶劑理論。
疏溶劑理論：當一個非極性溶質或溶質分子中的非極性部分與極性溶劑相接觸時，相互產生斥力，自由能（G）增加，熵減小，不穩定性增加。根據熱力學第二定律，系統由不穩定到穩定是自發的，即熵增加是自發的。因此，為了彌補熵的損失，溶質分子中非極性部分結構的取向，將導致在極性溶劑中形成一個「容腔」，這種效應稱為疏溶劑或疏水效應。該理論認為，在鍵合相反相色譜法中溶質的保留主要不是由於溶質分子與鍵合相間的色散力，而是溶質分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質分子與鍵合相的烴基發生疏水締合，且締合反應是可逆的。容量因子k與自由能變化△G的關系如下式：
lnk＝lnV/V－△G/RT (8·5)
上式中的R為理想氣體常數、T為熱力學溫度、V是色譜柱中鍵合相表面所鍵合的官能團的體積，V是色譜柱中流動相的體積。該式說明△G越大，被分離組分的k越小，保留時間越短。
(2)★★流動相的極性與容量因子的關系 流動相的極性增大，洗脫能力降低，溶質的k增大，t增大；反之,k與t減小。分離結構相近的組分時，極性大的組分先出柱。
(3) 特點 反相色譜法是應用最廣的色譜法，主要用於分離非極性至中等極性的各類分子型化合物，因為鍵合相表面的官能團不流失，溶劑的極性可以在很大范圍內調整，因此應用范圍很寬。由它派生的反相離子對色譜法與離子抑制色譜法，可以分離有機酸、鹼、鹽等離子型化合物。用反相液相色譜法，可以解決80%左右的液相色譜課題。因此，必須給予反相色譜法足夠的重視。對於結構異構體等難分離物質的分離，則應選用吸附色譜法。

㈣ 液相色譜柱子所用的化學鍵合相填料主要有哪些類型

常見色譜柱中的填料分類

1、液相

a、反相（與離子對）方法
C18（十八烷基或ODS）----------- 普適性好；保留性強，用途廣
C8（辛基） -----------與C18相似，但保留值稍小
C3，C4 -----------保留值小；大多用於肽類與蛋白質
C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不穩定
苯基，苯乙基 -----------保留值適中；選擇性有所不同
CN（氰基） -----------保留值適中；正相和反相均可使用
NH2（氨基） -----------保留性弱；用於烴類；欠穩定
聚苯乙烯基b -----------在1＜PH＜13的流動相中穩定；對某些分 離峰形好，柱子壽命長

b、正相方法
CN（氰基） -----------普適性好；極性適中；用途廣
OH（二醇基） -----------極性大於CN
NH2（氨基） -----------極性大，欠穩定
硅膠b ------------普適性好；價廉；操作欠方便；用於制備LC

c、空間排阻方法
硅膠b -----------普適性極好；作吸附劑用
硅烷化硅膠 -----------吸附性弱，溶劑兼容性好；適用於有機溶劑
OH（二醇基） ------------欠穩定；在水SEC中使用（凝膠過濾）
聚苯乙烯基b ------------廣泛用於有機SEC（凝膠滲透）；一般與水和極性大的有機溶劑不相容

d、離子交換方法
鍵合相 ------------穩定性與重現性均不好
聚苯乙烯基b -------------柱效不高；穩定；重現性好

a ：除另有說明，均為硅膠基質鍵合相
b ：此類填料為非鍵合相

㈤ 簡述hplc級流動相使用前如何處理

一、基質（擔體）

HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，最終使柱效降低。

1．基質的種類

1）硅膠

硅膠是HPLC填料中最普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，製成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用於廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在鹼性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。

硅膠的主要性能參數有：

①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響鹼性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；後者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，鹼性成份不拖尾。

2）氧化鋁

具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，並顯示出優秀的pH穩定性。

3）聚合物

以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用於普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強鹼來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸鹼，但也可以承受在pH13下反復沖洗。

所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用於HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對於大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用於分離大分子物質。

2．基質的選擇

硅膠基質的填料被用於大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用於大分子量的被分析物質，主要用來製成分子排阻和離子交換柱。

二、化學鍵合固定相

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，並且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。

1．鍵合相的性質

目前，化學鍵合相廣泛採用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而製得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由於空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。

殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是鹼性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使鹼性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應後，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的"濕潤"性能。

由於不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。

pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。

2．鍵合相的種類

化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基於極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，並常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。

另外C18柱穩定性較高，這是由於長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。

3．固定相的選擇

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用於糖類的分析，但它不能用於分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 鹼。二醇基鍵合相適用於分離有機酸、甾體和蛋白質。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用於分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用於極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用於分離芳香化合物。
另外，美國葯典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易於重現；而中國葯典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難於重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相

1．流動相的性質要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。

選好填料（固定相）後，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。鹼性流動相不能用於硅膠柱系統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。

2．流動相的選擇

在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常採用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所佔比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦採用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，並可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優於甲醇-水系統。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值並分離良好，也需採用梯度洗脫技術。

反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：

C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇

C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當於89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。

3．流動相的pH值

採用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱鹼（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

註：流動相中加入有機胺可以減弱鹼性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

4．流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（雜訊增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若採用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。

在線（系統內）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難於普及。

5．流動相的濾過

所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明"已濾過"）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用於過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用於過濾水溶液，嚴禁用於有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。

6．流動相的貯存

流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用於HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。

7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不採用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和乾燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。

8．HPLC用水

HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用於I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。

I類水標准：
NCCLS ASTM
電阻率，MΩ•cm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸鹽，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，µm濾器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三檔
美國葯典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標准蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ•cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國葯典純水≤10ppm）。

㈥ 什麼是化學鍵合固定相有什麼優點

利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面形成的固定相稱為化學鍵合固定相.
優點:①固定相表面沒有液坑,比一般液體固定相傳質快的多.
②無固定相流失,增加了色譜柱的穩定性及壽命.
③可以鍵合不同的官能團,能靈活地改變選擇性,可應用與多種色譜類型及樣品的分析.
④有利於梯度洗提,也有利於配用靈敏的檢測器和餾分的收集.

㈦ 鍵合相色譜法的鍵合相的種類（三種）

非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；
用於反相色譜；
長鏈烷基可使溶質的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩定性更好。 醚基和二羥基等鍵合相；
用於反相或正相色譜。 常用氨基﹑氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)鍵合硅膠；
一般用於正相色譜 。

㈧ 化學鍵合相的名詞解釋

化學鍵合相所屬現代詞，指的是採用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法。
化學鍵合相色譜法（CBPC）採用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。
以化學鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學鍵合相層析。