Ⅰ western顯影曝光後可以看到蛋白條帶，但是背景很深，加入ECL顯色液後整張膜都有熒光，用1%BSA室溫封閉1h。
不明白你想問什麼。
但依你說的這種情況，應該是想求得解決方法吧。只要將ECL顯色液稀釋後用，黑暗下熒光若隱若現，再壓片時間久一點，3min，顯出來的片子背景會淺很多，條帶應該會相應好看很多
Ⅱ 如何做好ECL發光檢測實驗
Western blot顯色的方法主要有以下幾種：一、放射自顯影，二、 底物化學發光ECL，三、底物熒光ECF，四、底物DAB呈色。現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot顯色底物是化學發光底物，發表文章通常也是用底物化學發光ECL。
ECL法檢測辣根過氧化物酶的原理是辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾（lumino，氨基苯二醯一肼）並發光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過將印記放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。ECL法操作簡便，應用現成的試劑盒，按照說明，將兩種顯色底物等體積混合後將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面，顯影、定影（或用熒光檢測儀檢測）
ECL Western特異發光檢測試劑盒用於辣根過氧化物酶(HRP)標記的蛋白或核酸檢測。下面以engreen的超敏型ECL發光液Enlight-Plus為例，說一下檢測 實驗步驟 。
1. 常規電泳、轉膜、HRP 標記抗體或核酸探針孵育、洗膜。以下操作在室溫進行。
注意：Enlight-Plus 推薦的抗體稀釋度為:
儲存液濃度為1mg/ml 的一抗推薦稀釋度 儲存液濃度為1mg/ml 的二抗推薦稀釋度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2.新鮮配製發光工作液。將BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，製成發光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 發光工作液)。轉移到清潔的塑料小盒中。
3. 用鑷子將漂洗過的膜取出，將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多餘的洗液，但勿使膜完全乾燥。將膜轉移至有發光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，輕輕搖晃，室溫孵育幾十秒到1 分鍾。
4. 用鑷子將膜夾起5-10 秒，並將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多餘的發光液，迅速將膜完全包裹於潔凈保鮮膜內，去除氣泡和褶皺，蛋白面朝上固定於X 片暗盒內。
5. 在黑暗中一次重疊放入3 張X 光膠片，30 分鍾或更長時間後全部取出顯影。
6. 對同一張膜進行多次蛋白雜交：用PBST 或TBST 洗滌掉發光液（10min×3 次），然後從開始一抗雜交即可。
ECL的使用注意事項 ：
1. 發光液不宜暴露於強光下時間過久，請避光保存，在暗室操作。
2. 為了得到最佳的曝光效果，優化一抗、二抗的稀釋比例。
3. 請選擇高質量保鮮膜。
4. 對於Enlight發光液，應避免使用NaN3 回收HRP 偶聯的抗體，因為NaN3 能抑制HRP 的活性。
Ⅲ Western blot化學發光(ECL)時，膠片上條帶很弱怎麼辦
條帶弱的原因可能有以下幾個方面：
①.因為蛋白上樣量低或目的蛋白在來源組織或細胞中的表達量並不豐富造成。可適當加大蛋白上樣量，也可通過提高抗體稀釋度或採用靈敏度更高的發光底物來調整，目前國產試劑盒中上海炎熙生物的極敏型ECL試劑盒靈敏度最高了，達到了pg級別，很合適表達不高的蛋白。
②. 蛋白沒有充分轉移到膜上。
③. 抗體效價不高，用量不足，孵育時間太短，或抗體反復使用保存不當而失活。
④. 曝光時間太短。可適當延長曝光時間。
Ⅳ Western Blot化學發光(ECL)時，膠片上條帶很濃怎麼辦
如果重新做的話，建議如下：
降低上樣量
降低抗體濃度，尤其是二抗
減少曝光時間
如果是已經濃了，想要在目前的片子上再努努力，那隻能是看看過一會兒去曝信號是不是能弱點了。其他的洗膠片信號，剝脫銀離子的試劑還得單獨買，不太現實。如果是機器拍的，就只能過一段時間拍一張，看什麼時候淡了，什麼時候用了。
Ⅳ western blotting 的過程和原理
什麼理論過程？就是原理唄？
WesternBlot原理、顯色分類及操作步驟
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。
western顯色的方法主要有以下幾種：
i.放射自顯影
ii.底物化學發光ECL
iii.底物熒光ECF
iv.底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
二、操作步驟：
(一)配膠
1、注意一定要將玻璃板洗凈，最後用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置於干凈的紙巾晾乾。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾後作為儲存液避光存放於4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鍾），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。
2、封膠：
灌入2/3的分離膠後應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠後切記，勿動。
待膠凝後將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然後加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻後倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。
3、灌好濃縮膠後1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子後用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨後用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠後用較薄的梳子再次插入梳孔後加水拔出。30min後即可上樣，長時間有利於膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯醯胺如有沉澱，最好棄掉.)
(二)樣品處理
1．培養的細胞（定性）：
⑴去培養液後用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵對於6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。
⑶100℃，1min。
⑷用細胞刮刮下細胞後在EP管中煮沸10min，期間vortex2~3次。
⑸用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置於0℃後在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便於上樣。
⑹待樣品恢復到室溫後上樣。
2．培養的細胞（定量）：
⑴去培養液後用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵加入適量的冰預冷的裂解液後置於冰上10~20min。
⑶用細胞刮刮下細胞，收集在EP管後超聲（100~200w）3s，2次。
⑷12000g離心，4℃，2min。
⑸取少量上清進行定量。
⑹將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱後加loadingbuffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loadingbuffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴勻漿對於心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵12000g離心，4℃，2min。
⑶取少量上清進行定量。
⑷將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱加loadingbuffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loadingbuffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM
由於蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。
對於心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)
(三)電泳
1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。
2．所有蛋白樣品調至等濃度後上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loadingbuffer調整至與樣品等體積。
2．以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳。
3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。
電泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L
Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L
(四)轉膜
1．電泳結束前20分鍾左右戴上手套開始准備：
濕轉使用常規電轉液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去離子水至1,000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪於去離子水面，靠毛細作用自然吸水後再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨後浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上後轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。
2．取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以後雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置於潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（干轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路）
3．轉膜：
濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾乾，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪於海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊後放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置於冰水混合物中。恆流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。
電轉液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封閉及雜交
1．封閉：
將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒於封閉液中緩慢搖盪一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫後封閉，如用蛋白marker則可省略此步。
2．結合一抗：
一抗的准備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加於搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。
3．洗滌：
一抗孵育結束後，用PBST或TTBS漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
4．結合二抗：
根據一抗來源選擇合適的二抗，根據鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。
5．洗滌：
二抗孵育結束後，用PBST或TTBS漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)
Tween-200.01%~0.02%NaCl150mM
Tween-200.05%
封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時取200mlPBST或TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。
(六)發光鑒定
一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或鹼性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。
1．HRP-ECL發光法：
將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆於A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）後濾紙貼角吸干，置於保鮮膜內固定於片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下後放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾乾，標定Marker，進行分析與掃描。
2．AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解於30ml水中，使用前將一片分裝在30個EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆於NBT/BICP溶液液滴上，並用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s後每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗後放濾紙上晾乾即可觀察與掃描。
背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果暴光時間長達半小時，出現背景是正常的。
三、注意事項：
增強敏感性
若目的條帶未出現，或很淡，可試用以下方法增強發光強度：
用清水漂洗膜數分鍾，重加發光液進行曝光，可延長曝光時間。
將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。
封閉40~60min
一抗雜交，室溫1h。37℃1h會更強，但可能增加非特異條帶。
PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
二抗雜交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
發光鑒定。
若條帶仍未出現或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
10．三抗雜交，室溫1h。37℃1h會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
12．發光鑒定。
一抗溶液中加入0.2%疊氮鈉後可4℃存放至少2周（一個月我也用過，沒問題，再長時間還沒試）
(七)NC膜的多次使用
一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與「七．增強敏感性」相近。
如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發光液（10min×3次）後從一抗雜交開始，後續步驟同前。
如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用strip液（可用雜交袋）於室溫搖動洗滌30min~60min，然後用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。
對於雜交若干次的膜，如果常規洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）於50℃洗滌30min，然後用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。
Ⅵ ECL發光試劑盒AB液混合後就發光正常嗎
您要先明白ECL發光液發光原理：一般的發光試劑含魯米諾和H2O2、發光增強劑等物質。發光試劑中的魯米諾被HRP和H2O2氧化，產生熒光。所以AB液混合後發光是正常的，但是發光時間長短和發光液有很大關系，好的發光液比如英格恩公司的EnlithtTM,靈敏度高又不容易淬滅，是蛋白檢測實驗的一大助力。
Ⅶ western blot時，ecl發光工作液怎麼配製
最簡單的辦法，比比兩個瓶子的大小，如果一樣大，就是1:1混合，如果大小差異很大，可能是1:40混合的。所以知道要用多少體積的底物，根據比例就能算出來。
但是最保險的辦法，還是根據產品說明，或者貨號在網上找一下說明書，應該也比較簡單的。
Ⅷ 化學發光試劑盒測定結果的驗證方法有哪些
將印跡膜置於封閉液中，室溫輕輕震盪20-60min，以封閉掉非特異性位點。
棄去封閉液，加入適量的一抗溶液，於搖床上輕輕震盪1h。（也可將印跡膜與一抗在2-8°C條件下孵育過夜。）
將印跡膜於洗脫液中懸浮清洗5min以上，並更換洗脫液4-6次。
4
將印跡膜與適量的HRP-結合物置於搖床上輕輕震盪，室溫孵育1h。
5
重復步驟3以去除未結合的HRP-結合物
6
將A液和B液以1：1混合即得到超敏ECL化學發光工作液，推薦使用量為0.1mL/cm2。
7
將工作液與印跡膜於室溫孵育5min。
8
將膜從工作液中取出，並用吸水紙吸去多餘的液體，置於兩層干凈的保鮮膜之間，小心擠出印跡膜與保鮮膜之間的氣泡。
9
將印跡膜置於暗盒中，蛋白面朝上，於暗室中進行X-光膠片曝光。
10
建議首次曝光時間為60s，進而通過調整曝光時間獲得較好的實驗結果。
Ⅸ Western-blot實驗ECL發光檢測實驗步驟
ECL Western特異發光檢測試劑盒用於辣根過氧化物酶(HRP)標記的蛋白或核酸檢測。下面以engreen的超敏型ECL發光液Enlight-Plus為例，說一下檢測實驗步驟。
1. 常規電泳、轉膜、HRP 標記抗體或核酸探針孵育、洗膜。以下操作在室溫進行。
注意：Enlight-Plus 推薦的抗體稀釋度為:
儲存液濃度為1mg/ml 的一抗推薦稀釋度 儲存液濃度為1mg/ml 的二抗推薦稀釋度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2. 新鮮配製發光工作液。將BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，製成發光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 發光工作液)。轉移到清潔的塑料小盒中。
3. 用鑷子將漂洗過的膜取出，將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多餘的洗液，但勿使膜完全乾燥。將膜轉移至有發光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，輕輕搖晃，室溫孵育幾十秒到1 分鍾。
4. 用鑷子將膜夾起5-10 秒，並將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多餘的發光液，迅速將膜完全包裹於潔凈保鮮膜內，去除氣泡和褶皺，蛋白面朝上固定於X 片暗盒內。
5. 在黑暗中一次重疊放入3 張X 光膠片，30 分鍾或更長時間後全部取出顯影。
6. 對同一張膜進行多次蛋白雜交：用PBST 或TBST 洗滌掉發光液（10min×3 次），然後從開始一抗雜交即可。
Western-blot中ECL發光液的選擇很重要，Enlight-Plus檢測級別可達pg級，發光時間長，背景低，得到的圖像很漂亮，非常有利於實驗的進行。
Ⅹ 鐵氰酸鹽是一種ecl發光試劑嗎
超敏ECL化學發光試劑(LumiPico® ECL Reagent)
一、用途：
本試劑是非放射性發光系統，用於檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達1-5pg。用X光片可快速地獲得永久的硬拷貝結果。所含獨特的底物足以維持12小時以上的發光，便於反復曝光操作，免疫印跡膜經抗體脫卸處理後可供再次抗體探查使用。適用於痕量蛋白或核酸檢測。特別節省抗體(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。
二、原理：
辣根過氧化酶使試劑中的發光物（Luminol）氧化並發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將復雜的蛋白混合物經SDS-PAGE分離，並轉移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用於免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。當加入免疫印跡化學發光試劑後，Luminol發生氧化降解，並發射波長為428nm的光，此光可經X光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。
三、使用方法：
1. 印跡膜制備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP，一般採用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對於降低背景非常重要，在與HRP交聯物溫育後，膜片更需仔細洗滌，所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合後盡快使用。將膜片置混合液中於室溫下振盪溫育2分鍾，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號顯現
1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置於吸水紙以吸去過量試劑。
2). 置膜片於二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置於X光片盒中。
4). 於暗室中壓上X光片。
5).根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果。顯影沖洗。
6). 調節曝光時間，再次曝光顯影。
4、膜的重復使用：
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入後，70?C振盪水浴30分鍾。再用TBST或PBST緩沖液洗脫，最後用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。