哪些屬化學法測序

A. 請問新一代的DNA測序技術—合成法測序的原理及其步驟是什麼

合成法測序原理：將基因組DNA的鄭旦仔隨機片段附著到光學透明的玻璃表面喊汪（即Flow cell），這些DNA片段經過延伸和橋式擴增後，在Flow cell上形成了數以億計Cluster，每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然後利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測的模板DNA進行測遲御序。

B. 加減法DNA測序整個過程和化學測序的過程（最好有圖片說明）

以下都是思路，具體的反應和實驗細節，假如思路清楚後，隨便找一本實驗書就可以明白。這兩種方法，思路上很簡單，很多教科書，特別是實驗書上都有圖可參考。因為不懂，所以更要多看多翻多想。
【下面的回答，有謬誤，請大家指正和完善】
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加-減法（plus-minus sequencing）: Sanger於1975年發明，使人們有可能第一次「讀」出DNA的鹼基序列。

首先，在做「加法體系」和「減法體系」以前的工作。
待測DNA的單鏈作為模板，一個合適的引物，四種dNTP，用同位素標記。
DNA聚合酶從引物開備碧始合成一條互補鏈，理想情況是，合成所產生各種長度的片段都存在。
然後除去那些未參與合成的dNTP，將剩下的合成產物，分成兩部分。
一部分用於加法系統，一部分用於減法系統。

加法系統：將用於加法系統的產物再分成四小份，每一小份中僅僅將四份中的dNTP的一種加入反應體系。比如僅加入dATP。由於DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性，而反應體系中缺少另外三種必要的dNTP，合成產物就從3′→5′方向降解。然而由於存在dATP，顯然遇到dA的位置降解反應就停止了。因而所有的片段都是以A結尾的。同理，可以分別制備以C、G或T結尾的另外三組片段。
四組片段在同一塊凝膠板的不同樣品槽中同時電泳（這類圖LZ可以在書上隨便找到），從放射自顯圖上就可以推斷出鹼基序列，因為從A樣品槽查出的放射性區帶代表A在片段中的位置，同理也可定出C、G和T的位置。
【加法系統實際就是以降解為條件，以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性為基礎，當降解過程遇到試劑中所富含的dNTP時，反應就停止】

按理只用一個加法系統就足以推斷DNA的鹼基序列了。但由於技術上的原因，只用一種方法有時不能得到完全正確的結果，因此又設計了一種減法系統。

減法系統：也是將上述酶促產物分成四小份，每一小份中只加入三種dNTP，比如缺少dATP。在這個反應體系中，DNA聚合酶能夠把片段繼續合成下去，但是在遇到應該是dATP參入的位置時，合成反應就停下來了。這就可以得到一個都是以A前一個位置為結尾的片段組，電泳後同樣可以定出A的位置。
【減法系統實際就是以合成為條件，當合成過程缺少需要的dNTP時，反應就停止】

但此加減法並不盡如人意，由於反應速度上的差異，有些片段可能多些，另一些片段可能少些，有時可能導致漏讀和重讀，有時圖譜上還會出現假譜線，當同樣鹼基排列時圖譜上有時只出現一條帶。因此用這個方法測定DNA片段可能有1/50的誤差。目前常用的是它的改進法-雙脫氧末端終止法。

剩下的就是讀板的問題，可以想到，在理想情況下，比如以A結尾的各種長度的片段，出現的可能性是均等的。那麼在聚丙烯醯胺凝膠電泳中，相對分子量小的片段遷移速度快。書上的圖，都是一塊板子，有四個列，分別是以四種不同結尾的核苷酸的電泳情況。跑在越前面的（也就是最靠近底部的），就第一個被讀出來，隨後的相對分子量不斷增大，遷移速度慢，也就是比較大的片段，按其順序和所處的列，就克直觀讀出序列。

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【化學法（chemical method）】由Maxam-Gilbert在1977年發明。

一、取待測DNA片段，既可以是單鏈也可以是雙鏈。
此法又叫化學切割法，或化學降解法，切割之前先對待測片段作末端標記。用放射性P32-磷酸集團標記鏈的末端之一。

二、將標記完的樣品，分成四份。分別好滾巧採用不同的化學試劑對所得樣品，進行修飾進而切割【切割就是利用特異的化學試劑，修飾DNA分子中不同的鹼基，使被修飾的鹼基之間的連接變得不穩定，發生斷裂，而產生各種長度的DNA片段。】
【四組切割的方法，在G、G+A、T+C、C處切割】
「+」就是同時切割，有點討厭的是這點，能修飾A，使其糖苷鍵不穩定的甲酸，同時友鍵也會使G的不穩定，所以無奈就有了G+A並在一起，
（1）G反應，"硫酸二甲酯"，使鳥嘌呤G的N7原子甲基化，而與脫氧戊糖之間的糖苷鍵不穩定，可在中性環境中受熱斷裂，得到一系列G末端的片段。
（2）G+A反應 "甲酸",使A和G嘌呤環上的N原子質子化，糖苷鍵變得不穩定，可用哌啶將其斷裂，得到一系列A和G混合的末端的片段。
（3）T+C反應 "肼"，使T和C的嘧啶環斷裂，通過消除反應，使DNA鏈發生斷裂，得到一系列T+C末端的片段。
（4）C反應 在NaCl存在時，只有C與肼反應，得到一系列C末端的片段。

用上面加減法一樣的電泳，克得到結果，直觀讀出。
至於為什麼（2）（3）兩步，為什麼是G+A、T+C？
事實上，如果有單獨只斷A的或只斷T的修飾方法，也可以。但從書上列出的圖中，可以看出，斷裂的混合物G+A、T+C電泳後並不影響讀結果。
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C. 馬克薩姆·吉爾伯特化學測序法

是測定DNA序列(一級結構)的一種基本方法。

策略：生成互相獨立的若喚旁鍵干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止於特定的一種或多種殘基上。由於DNA鏈上每一個鹼基出現在可變終止端啟汪的機會均等，因而上述每一組產物都是一些寡核苷酸的混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定鹼基在原DNA片段上的位置所決定。然後在可以區分長度僅相差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣於測序凝膠中若干個相鄰的泳道之上，即可從凝膠的放射和巧自顯影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。

基本步驟：(1)先將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨立的化學反應中分別進行特定鹼基的化學修飾；(3)在修飾鹼基位置化學法斷開DNA鏈；(4)聚丙烯醯胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據放射自顯影顯示區帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。

D. 【現學現賣】實驗-DNA測序（第一代至第三代）

測序，簡單來說就是將DNA化學信號轉變為計算機可處理的數字信號。

一代測序

首先講一下測序的基礎方法，Sanger測序 (Sanger et al.,1977)

1977年Frederick Sanger和同事發展出雙脫氧測序法（dideoxy sequencing method）或稱鏈終止法，並對噬菌體phiX-174測序以來，測序原理並未有太多變化。後來測序方法的改革也幾乎都是在此基礎上，縮短時間，降低人力，比如①在每一種ddNTP中摻入不同的熒游標記，使測序在單一反應中就能進行。②使用極薄極長的充膠玻璃毛細管代替大的聚丙烯醯胺凝膠塊，新的介質缺緩散散熱更快，使電泳能在高壓下進行，降低分離時間等諸如此類的減少分離時間的變革。③更換探查單一核苷酸的方法，用微轉換器控制通過的電流檢測核苷酸等等。

Sanger法測序需要引物，DNA聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的雙脫氧核苷三哪胡磷酸（ddNTPs）。按照鹼基配對原則，dNTPs在引物之後按照模板延伸，ddNTPs的隨機加入會由於它缺乏連接下一個的3』羥基而導致反應終止，由於ddNTPs的結合位置隨機，我們會得到一系列大小不同的片段，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或同位素標記進行檢測。也正是這個原理，所以測序得到較長的序列的概率低，長序列往往需要雙向測序再進行拼接。

Maxam gilbert 化學法測序 (Maxam and Gilbert,1977)

幾乎同時，Maxam和Gilbert發明了化學鏈降解法測序。

通過化學終止反應測序。首先雙鏈變單鏈，准備工作完成。採用特定的化學試劑來從DNA鏈上斷裂特定鹼基，在5』端磷酸化（32P），四種化學反應：G反應，A+G反應，T+C反應，C反應，分別進行並產生一系列片段。然後進行電泳（electrophoresis），放射自顯影（radioautography），最後可以整理得到序列。

二代測序（目前擁有這些測序儀的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收購life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官網可以找到這些測序儀），Roche）

一些和前後都沒有緊密聯系的概念

深度測序（deep sequencing）不是什麼測序方法，而是根據對目的基因測序的depth和coverage（C）對測序方法的歸類。如果這個片段被測序了大於7次（伏氏coverage>7），那麼基本可以說是深度測序，大於100×稱為ultra deep sequencing。還有一些概念比如length of genome（G）指全基因組長度，number of reads（N）片段數量，average read length（L）。

C=N×（L/G）

pyrosequencing 焦磷酸測序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代測序 (Jarvie, 2005)

焦磷酸測序法

它後來發展稱為Roche公司454技術所使用的測序方法。

是一種酶聯級聯測序技術，准確度可與Sanger媲美，且速度大大提高。具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為大通量，低成本，快速地進行單核苷酸多態性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技術支持。改進後的焦磷酸測序技術可以滿足上百個核苷酸測序。但是測序長度一般在100bp左右，一直用於短序列分析。它的技術原理是4種酶在同一反應體系種級聯化學發光反應，引物與模板DNA退火後，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），熒光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）協同作用下，檢測熒光，實時測定DNA序列。

454測序-固定的焦磷酸測序體系（2016年被Roche公司淘汰）

首先是序列處理：全基因組DNA處理為小的片段（鳥槍法處理的），在一端連接兩端分別連接A和B（可以在PCR中產生大量的目的序列），然後解鏈變成帶有adaptors的單鏈DNA，這個adaptorA的序列可以與小珠子上面的短序列B匹配，這樣我們要測序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且與酶不反應的分子，作為固定表面。然後進行乳化PCR，得到了滿載分子的小珠子並將它們放入小孔。接下來是焦磷酸測序的原理，引物是adaptorA，每次反應加一種dNTP，如果可以鹼基配對，會在DNA聚合酶下結合在引物末端，釋放一個分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi與APS結合形成ATP，ATP與熒光素在熒光素酶作用下形成氧化熒光素，產生可見光。反應後沖洗掉剩餘dNTP和少量ATP。

大多數現代測序方法都是分為這幾步，主旨是實現高通量和自動化。①全基因組片段化。②adapter ligation末端連接短序列。③目標DNA與分子小珠子的結合。④將小珠子載入到孔板。⑤採用適合的方法測序。⑥數據處理。

連接酶法測序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID測序  (Hedges et al.,2011)

連接酶測序法

利用的是DNA ligase的一個特性。連接酶是將DNA分子末端連接在一起的酶，它對DNA結構敏感，如果兩條鏈的鹼基不匹配，那麼酶的效率很低。

具體如下圖，模板鏈連接P1Adaptor，引入引物Pn與探針寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前兩個是與模板結合的鹼基，中間三個為universal配對，後三個也是且5』連接熒游標記。在酶的作用下，正確配對的探針偏向與模板結合，然後熒光信號被檢測並切除，露出5』端，繼續反應。中間NNN的鹼基部分可以通過加入引物Pn-1的方法，進行錯位測序，之後整合數據。

ABI公司SOLID測序平台

在前期准備上與454測序相似，也會用到小分子的beads。但是測序方法為連接酶法，不是焦磷酸。

鳥槍法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 測序- Ion torrent 公司PGM測序 (Merriman et al.,2012)

鳥槍法

傳統的sanger法適合短一些的序列，當處理比如人類基因組的長序列時，需要鳥槍法將長序列變成短序列。並不是一個獨特的測序方法，應該算是前處理技術。這些通過鳥槍法處理得到的短序列位點和長度隨機，稱為contigs（重疊群/連接片段）。然後用不同的測序方法測序，將結果輸入電腦，它用演算法（algorithm）將contigs的重疊部分進行拼接，得到完整序列。

Ion Torrent公司Proton測序儀

此方法比較快速。測序的原理與其他的不同，檢測的不是熒光信號，而是核苷酸結合時釋放的氫離子H+。同樣全基因組→片段化，單鏈→連接adaptor→adaptors配對連接beads小分子→乳化PCR amplify。這些步驟與其他二代測序一樣，不同的是Ion Torrent採用半導體晶元代替之前的孔板，載入攜帶序列的小分子在晶元上，晶元由可以承載小分子beads的孔和感受pH的感測器構成，這樣前期准備就完成了。測序也是逐個加入四種核苷酸，檢測產生的氫原子對溶液pH的影響，收集處理信號。

illumina 公司測序平台目前占據大部分市場，以HiSeq系列為主 (Quail et al., 2008)

特點是很便宜，速度也很快。①前期對基因組的片段化以及兩端連接adaptorA,B與其他二代測序技術類似，②不同的是它沒有用beads，核心反應容器是可以吸附流動DNA片段的測序流動槽（flowcell），每個flowcell上有8個道（lane），lane上面有與adaptorA,B相互配對的序列，所以可以固定DNA。③橋式PCR擴增與變性。先因為adaptorA,B序列而結合，形成拱橋性狀，開始擴增，完成後雙鏈和兩端會再變性分開，新產生的單鏈作為模板再開始橋式反應。最後的結果是會產生一簇正反向的目的片段（詳見下圖）。④測序，檢測熒光信號，整合結果。

第三代測序

PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies納米孔單分子測序技術被稱為第三代測序技術。其特點是不需要進行擴增，就是說小分子beads/橋式PCR的步驟是不需要的，而且產生的reads（讀長）較長（>20kb）。

PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015)

這個方法有點在上面提了，且速度快，由於是實時檢測，所以還可以檢測鹼基的表觀修飾情況，如甲基化。但是缺點是錯誤率太高，以缺失序列和錯位居多。SMRT晶元為測序載體（如同flowcell），不同鹼基用不同熒游標記，在合成配對時檢測熒光信號。

實現實時長序列測序的關鍵第一是採用的DNA聚合酶的活性保持，第二是區分配對的反應信號與周圍游離鹼基的強大背景熒光，採用零模波導孔原理，在反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多圓形納米小孔達到降噪檢測的目的。

Oxford Nanopore  的MinION (Mikheyev and Tin,2014)

是基於電信號的測序。它的特點是儀器真的非常小，reads更加長（幾十甚至上百kb），而且DNA在測序中不被破壞，但是錯誤率同樣很高。它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代測序方法那樣需要事先對基因組進行bisulfite處理，這是因為存在表觀修飾的鹼基激發的電流強度是不同的。這對於在基因組水平直接研究表觀遺傳等相關現象有極大的幫助。

技術核心是特殊的納米孔，孔內共價結合分子接頭。當DNA分子通過納米孔時，它們使電荷發生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種鹼基所影響的電流變化幅度是不同的），最後高靈敏度的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的鹼基。

參考文獻

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Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies.  Drug Discovery Today: Technologies   2 : 255-260.

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Merriman, B., D Team, I.T., and Rothberg, J.M. (2012) Progress in ion torrent semiconctor chip based sequencing.  Electrophoresis   33 : 3397-3417.

Mikheyev, A.S., and Tin, M.M. (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer.  Molecular ecology resources   14 : 1097-1102.

Quail, M.A., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, P.J., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.  Nature methods   5 : 1005.

Rhoads, A., and Au, K.F. (2015) PacBio sequencing and its applications.  Genomics, proteomics & bioinformatics   13 : 278-289.

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Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.  Proceedings of the national academy of sciences   74 : 5463-5467.

Sutton, G.G., White, O., Adams, M.D., and Kerlavage, A.R. (1995) TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects.  Genome Science and Technology   1 : 9-19.

E. dna測序有化學法和酶法兩種，一般是指哪一種

高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（Next-generation sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
根據發展歷史、影響豎棚力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆穗纖段（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析儀(即DNA測序儀)，猜譽採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個鹼基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的熒光，並在CCD攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。

F. DNA測序可以採用哪些手段，並闡述各自的原理

這位是搞分子生物學的嗎?
DNA測序的方法有很多種. 目前最常見的是雙脫氧終止法了. 在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙悶尺差脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然後進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由於其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續延伸. 所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾, 第四個反應的都以T結尾, 電泳後就可以讀出序列了. 也許這樣說你不一定明白. 舉一個例子, 假如有一個DNA, 互補序列是GATCCGAT, 我們試著做一下:
在第一個反應中由於含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三個鹼基時沒什麼問題, 但遇到A時, 摻入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一個如果參與反應的是ddATP則終止, 產生一個僅有2個核苷酸的序列: GA, 否則繼續延伸, 可以產生序列GATCCG, 又到了下一個A了. 同樣有兩種情況, 如果是ddATP摻入, 則產生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否則可以繼續延伸, 產生GATCCGAT.
所以在第一個反應系統中產生的都是以A結尾的片段:
GA, GATCCGA,
同理在第二個反應中產生的都是以C結尾困悉的片段:
GATC, GATCC,
在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段:
G, GATCCG
在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段:
GAT, GATCCGAT,
電泳時按分子量大小排列, A反應的片段長度為2, 7; C反應的為4, 5; G反應的為螞皮1, 6; T反應的為3, 8, 四個反應的產物分別電泳, 結果為

8 7 6 5 4 3 2 1

A | |
C | |
G | |
T | |

我們可以從右向左讀, 為GATCCGAT, 至此, 測序完成(上面這個圖在網路知道中顯示不正常, 因為網路知道的網頁用的是比例字體, 你如果想看它, 拷貝到記事本中, 用等寬的字體來看).

G. DNA的化學法（Gilbert法）測序步驟，注意不是SANGER

(1)先將DNA的末端啟旅之一進行標記,通常為放射性同位素32P;
(2)在多組互相獨立的化學反應中分別進褲慎行特定鹼基的化學修飾;
(3)在修飾鹼基位置化學法斷開DNA鏈;
(4)凝膠電泳將DNA鏈按長短分開;
(5)根據放射自顯影顯示區帶,直接讀出DNA的核苷酸序列
化學胡旁敬降解較之鏈終止法具有明顯優點:所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產生的拷貝.

H. 目前用於測序的技術主要有哪些

DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法與Gilbert（1977）發明的化學降解法。這兩種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的首敏姿點開始，隨機在某一個特拿型定的鹼基處終止，產生A，T，C，G四組不同長度的一系列者絕核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。

I. DNA測序有哪些方法

第1 代測序技術
熒游標記的Sanger 法—— 在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。用於測序的技術主要有Sanger（1977）發明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法，Sanger測序法得到了廣泛的應用。Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，並且在每個鹼基後面進行熒游標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA鹼基序列。 Sanger法測序的原理就是，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之擴增，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3『-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾個至千以上個，相差一個鹼基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
第2 代測序技術
循環陣列合成測序法—— 述第2 代測序技術中, 序列都是在熒光或者化學發光物質的協助下, 通過讀取DNA 聚合酶或DNA 連接酶將鹼基連接到DNA 鏈上過程中釋放出的光學信號而間接確定的. 除了需要昂貴的光學監測系統, 還要記錄、存儲並分析大量的光學圖像.這都使儀器的復雜性和成本增加. 依賴生物化學反應讀取鹼基序列更增加了試劑、耗材的使用, 在測序成本中比例相當大. 直接讀取序列信息, 不使用化學試劑, 對於進一步降低測序成本是非常可取的.在一個正在發生突破瓶頸巨變的領域內, 很難准確預測未來將發生什麼.
第3 代測序技術
直接測序——將基因組DNA 隨機切割成大約100 kb 左右的片段,製成單鏈並與六寡聚核苷酸探針雜交. 然後驅動結合了探針的基因組文庫片段通過可定址的納米孔陣列. 通過每個孔的離子電流均可獨立測量. 追蹤電流的變化確定探針雜交在每個基因組片段上的精確位置. 利用基因組片段上雜交探針的重疊區域將基因組片段文庫排列起來, 建立一組完整的基因組探針

J. 求高手指導DNA測序實驗怎麼做具體步驟是怎樣的

歷史是 Rober Holley，1965年發表於Science雜志上的文章報道了酵母丙氨酸tRNA序列，77鹼基。 吳瑞博士（Dr. Ray Wu）提出引物-延伸的測序策略。1971年首次成功的測定了λ噬菌體的兩個粘性末端。 F.Sanger，1977年，發表在Nature和PNAS上的文章描述了雙脫氧鏈終止法。諾貝爾獎獲得者。 A.M.Maxam和W.Gilbert，1977年，化學法測序。 雙脫氧鏈終鎮陪止法測序（又稱酶法，Sanger測序方法）： 對DNA進行體外合成時，將ddNTP與dNTP按一定的比例混合就可以得到一組大小不同、按照模板序列終止的DNA片段 如果引物是帶有標記的，在變性凝膠上做電泳分離，通過放射自顯影技術就可以檢測單鏈DNA片段，並進行認讀 化學法DNA測序（又稱Maxam-Gilbert法） 是一個DNA化學降御友蠢解的過程，而不是生物合成過程。 化學試劑處理具有末告舉端標記的DNA片段，造成鹼基的特異性切割，由此產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物。 經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影後，根據X光片所顯現的相應條帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。 PS:呵呵，我是說的最主要的小片段測序法，如果要是測比較大的序列，像人類基因組那類，我記得聽楊煥明教授說他們是用的鳥槍法，呵呵，要針對具體的實驗去選擇方法