㈠ 免疫組化 如何復染（免疫組化，蘇木精，鹽酸，石
（一）、儀器設備
1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；2）水浴鍋
（二）、試劑
1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.
2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g.
3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml.
4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml.
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。
7）封裱劑：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS（或PBS）配製。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。
（三）、操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。
1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；
2）無水乙醇中浸泡5分鍾；
3）95%乙醇中浸泡5分鍾；
4）70%乙醇中浸泡5分鍾；
2、抗原修復
用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。
1）抗原熱修復
（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。
（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。
（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫組織化學染色
SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鍾；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；
4）PBS洗2～3次各5分鍾； 5）抗原修復；
6）PBS洗2～3次各5分鍾；
7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。
10）PBS洗3次各5分鍾；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20.
13）PBS洗3次各5分鍾；
14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鍾；
16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鍾；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1）脫蠟、水化。
2）PBS洗兩次各5分鍾。
3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。
4）抗原修復。
5）PBS洗5分鍾。
6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。
7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。
8）PBS洗三次每次2分鍾。
9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分鍾。
10）PBC洗3次每次2分鍾。
11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。
12）PBS洗4次每次5分鍾。
13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。
15）脫水、透明、封片、鏡檢。
㈡ 免疫組化原理
免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助於了解疾病的發病機理和病理過程。
免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，製成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用於標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。