免疫組織化學染色有哪些方法

① 酶免疫細胞如何進行化學染色

免疫細胞化學染色是將血液、骨髓液、漿膜腔積液等等各種體液組織製成的塗片和骨髓等組織的切片經各種單克隆抗體的標定和常用的過氧化物酶或鹼性磷酸酶顯色後對白血病細胞直接鏡檢，以確定細胞類型。
免疫組織化學染色方法繁多，可根據標記物的不同分為：免疫酶細胞化學染色、免疫熒光細胞化學染色、免疫金銀染色技術以及親合免疫組織化學染色技術等。目前血液系統疾病檢查常用免疫細胞化學染色方法有三種：過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法、鹼性磷酸酶-抗鹼性磷酸酶（APAAP）法和親和素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC-AP）法。PAP法抗原、抗體反應及酶標原理與APAAP法完全相同，都屬於免疫組織化學反應，只是所標記的酶不同。PAP法酶化學反應原理與ABC-AP法完全相同，但ABC-AP法為親合免疫組織化學反應。在染色步驟及方法上PAP法和ABC-AP法完全相同。
免疫細胞化學能夠識別抗原蛋白質一級結構中氨基酸的差別，從而對細胞結構、功能及細胞代謝等進行綜合分析，確定細胞的類型、來源及細胞的分化階段。應用骨髓切片免疫組織化學技術可以對骨髓細胞進行原位觀察，通過對細胞特異性抗原的定性、定位和定量分析，了解骨髓組織和細胞的結構和變化，這對血液系統疾病尤其是血液系統腫瘤的診斷、鑒別診斷，以及血液腫瘤的分類、分型和預後的判斷提供了有利的研究手段。

② 常用免疫組織化學染色方法有哪些

常用免疫組織化學染色方法, LSAB法.(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脫蠟至水. 2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鍾. 3.水洗. 4.抗原修復. 5.PBS洗3次,1分鍾/次. 6.加入血清孵育10分鍾. 7.摔去血清,加入一抗孵育30-60分鍾. 8.PBS洗3次,每次2分鍾.加入二抗,孵育20分鍾. 9.PBS洗3次,每次2分鍾. 10.加入SP復合物孵育20-30分鍾. 11.PBS洗3次,每次2分鍾. 12.DAB-H2O2孵育5-10分鍾. 13.PBS洗,水洗. 14.Harris蘇木素染核5-10分鍾. 15.水洗,分化 ,藍化,脫水,透明並封固.

③ 免疫組織化學染色法的檢查過程

用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法，稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法，稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學分直接法、間接法和補體法。一、直接法(1) 檢查抗原方法這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，製成特異性熒光抗體，直接用於細胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用於腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。(2)檢查抗體方法將抗原標記上熒光素，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體在原位檢測出來。二、間接法(1)檢查抗體(夾心法)方法此法是先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。(2)檢查抗體方法用已知抗原細胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結合在抗原上的抗體反應，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。(3)檢查抗原法此法是直接法的重要改進，先用特異性抗體與細胞標本反應，隨後用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體與結合在抗原上的抗體結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用於同一種屬產生的多種第一抗體的標記顯示，這是現在最廣泛應用的技術。三、補體法(1)直接檢查組織內免疫復合物方法用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原-抗體-補體—抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫復合物上補體存在處，此法常用於腎穿刺組織活檢診斷等。(2)間接檢查組織內抗原方法常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育後，如發生抗原抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原-抗體-補體—熒光抗體的復合物，此法優點是只需一種熒光抗體可適用於各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。[1]四、雙重免疫熒光組織化學標記方法在同一組織標本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重熒光染色，一般均採用直接法，將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，加在標本上孵育後，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發黃綠色熒光;抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。

④ 組織學的染色方法有哪些

1、HE染色也叫蘇木精-伊紅染色法，是病理科切片染色技術中最常見的染色方法之一。HE染色法也是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法。HE染色利用蘇木素和伊紅分別顯示胞核和胞漿，可以區分出一般細胞的形態，在實際應用中可以鑒別組織、細胞的病理學改變，在臨床病理工作中是診斷良惡性疾病的最基本的染色方法。
2、免疫組化染色。是根據抗原和抗體特異性結合的原理，通過化學反應，使標記抗體的顯色劑顯色，來確定組織細胞內抗原的定位、定性及相對定量，是臨床病理診斷中常用的輔助病理診斷和分子分型、預後預測等重要的病理學染色技術。
3、PAS染色。又稱過碘酸-雪夫染色，糖原染色。一般用來顯示細胞內或細胞外的糖原和其他多糖物質。
4、巴氏染色。是脫落細胞染色中最好的染色方法。收起全部↑

⑤ 免疫組化及特殊染色是啥意思

免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。

免疫組織化學(immunohistochemistry)又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。

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免疫組織化學染色流程

一、目的：為了規范免疫組化染色過程中各步驟的規范化操作，以期獲得免疫組化結果的標准化，特製定本規范

二、范圍：適用於本科室免疫組化實驗室進行的所有免疫組化檢測；

三、權責：

1、本科室病理醫生根據診斷需要申請免疫組化檢測項目，在技術員完成染色後判讀結果；

2、免疫組化室技術員根據病理醫生申請的項目完成免疫組化的染色工作；

四、作業內容：

1、取材、固定、組織處理：參照《常規製片質量管理制度》；

2、診斷醫生電子申請免疫組化，組化室技術員核對並提交檔案室准備所需蠟塊，預先把標記及病理號記錄於載玻片上；

3、切片：切片厚度3-4um，採用陽離子玻片撈片，60°溫箱烘烤過夜；脫蠟步驟參照《常規製片質量管理制度》；

4、抗原修復：採用熱修復法，具體步驟如下：

（1）在盛裝PH6.0檸檬酸緩沖液的電飯鍋內放入切片；

（2）煮沸；

（3）保溫30分鍾，自然冷卻；

（4）染色方法：採用EnVision二步法；

（5）PBS沖洗，3*5分鍾。

⑥ 免疫組化原理、流程及結果分析

免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然後用HRP等標記的二抗與一抗進行結合，最後通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在於查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現。

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態學改變；而後者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。
通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。

免疫組化和****HE****染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜鹼性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色，經過一系列復雜的生化反應後，DAB(二氨基聯苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話，信號不夠強。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1、 ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力特性，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物，最後DAB顯色。
復合物配製：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素，但有兩個生物素親和力極高的結合位點，可以與二抗上的生物素結合，敏感性高，復合物不需要使用前混合，更為簡便。
3、 PAP法
4、 直接法

樣本制備

免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1 、必須設陽性對照和陰性對照。
2 、 抗原表達必須在特定部位。
3 、 陰性結果不能視為抗原不表達。

免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表

從表可以看出只有6、7實驗結果有意義。1-5均因對照組的結果已否定Ab的特異性或IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗或換用Ab。

染色失敗的幾種情況及原因:
1、 所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內。
2、 所有切片均呈陽性反應。
3、 所有切片背景過深。
4、 陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。

所有切片呈陽性反應，其原因:
1、 切片在染色過程中抗體過濃，或乾片了。
2、 緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不徹底。
3、 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應時間過長。
4、 抗體溫育的時間過長。
5、 H ₂ O ₂ 濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。

所有切片背景過深，其原因:
1、 內源性過氧化酶沒有完全阻斷。
2、 切片或塗片過厚。
3、 漂洗不夠。
4、 底物呈色反應過久。
5、 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當。

注意事項：
1、 蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
2、 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩乾洗滌液，但又防止乾片。
3、 以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應經常配製新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時，切片放傾斜。
⑤抗體孵育後PBS沖洗不充分。
⑥製片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
4、 一抗的清洗:
1、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2、溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
3、沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去 結合的物質。
5、 PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
2、中性及弱礆性條件（PH7-8）有利 於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利 於分解。
6、 拍照：
1、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。

⑦ 免疫組化的操作步驟

一 免疫組化（SP法）操作步驟
1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2.緩沖液洗 3min/2 次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。
4. 緩沖液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。
（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩沖液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩沖液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鍾。
10 ．緩沖液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鍾。
（註：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩沖液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 ⑴、石蠟切片脫蠟至水。
⑵、 3%H 2 O2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
⑶、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
⑸、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑺、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑻、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。
⑼、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。
⑽、顯色劑顯色 3-15 分鍾（DAB 或 NBT/BCIP）
⑾、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。 冰凍切片 4-8μm ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。