QPCR的化學方法有哪些

A. QPCR運行過程中儀器和電腦卡住了

可以嘗試重啟儀器。
如果重啟失敗可以聯系工程師。
即時聚合酶鏈鎖反應（Real-time polymerase Chain Reaction，簡稱 Real-time PCR、即時PCR），又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 Q-PCR/QPCR/qrt-PCR、定量即時PCR、即時定量PCR），是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環後產物總量的方法。
定量即時PCR及定量反轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）已被眾多科學家採用，因為其偵測范圍廣、靈敏度高、准確、專一及快速。qPCR的發展因為偵測感染病患的病毒或細菌量、癌症監測、診斷個別基因差異的用葯反應等應用而大幅提高。
qPCR的方法是基於偵測目標物在反應前及PCR後產物的量化關系。相對於終端PCR方式（end-point PCR，傳統的PCR配合凝膠電泳，在反應後偵測）qPCR有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要在PCR反應後的偵測步驟。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。qPCR分析亦適於更具挑戰性的應用，如多重偵測與高通量分析。

B. qpcr內參加幾行

5行。
qpcr是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應循環後產物總量的方法。
DNA由脫氧核苷酸組成的大分子聚合物。脫氧核苷酸由鹼基、脫氧核糖和磷酸構成。通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。

C. 純生信文章如何用qpcr來驗證

純生信文章用qpcr需要尋找網路中的關鍵模塊來驗證。利用Diffcorr包對關鍵模塊中的基因進行差異相關性分析，選擇差異相關性較大的基因進行生存分析，並利用RT-qPCR對進行驗證，從而確定肺腺癌中的關鍵基因。

qpcr的概括

QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱定量即時PCR、即時定量PCR，是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應循環後產物總量的方法。

qPCR分析亦適於更具挑戰性的應用，如多重偵測與高通量分析。qPCR有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要在PCR反應後的偵測步驟。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。

D. qpcr原理及應用是什麼

一、原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

1、 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2、 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈；

重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

二、應用

1、基因表達分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑒定一般需要花數周時間。

2015年時Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己發展的real time PCR檢測mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析715個檢體657個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為90.3%及98.6%。

整個實驗流程可以在5個小時內完成，此方法可以用於沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

2、檢驗生物晶元的結果；

3、siRNA與miRNA診斷；

4、基因型鑒定；

5、飲食分析；

6、獸醫微生物檢測。

特點

1、熒光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；

其次，用於檢測PCR產物實時檢測的熒光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出熒光信號。

2、每一輪循環中PCR的產出量都以熒光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中熒光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為CT(Threshold Cycle)，Ct值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說CT值會越小。

如果要確定量的話，需要做出標准曲線，以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的MIQE規范中Ct這個慣用的名詞被重新定義為Cq值(quantification cycle)。

E. qpcr條件怎麼調

qpcr條件需要根據引物和目的基因的長度進行調整，根據qpcr引物設計原則，引物的Tm值在60℃左右，因此這一步的溫度一般可設為60℃。 時間還需根據儀器使用要求進行設置，如ABI StepOne、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要設置30s，而ABI 7500則至少需要設置34s。
qpcr拓展知識: Quantitative Real-time PCR,中文名是 實時熒光定量PCR。 qpcr是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。

F. 簡述RT-qPCR的原理,簡要說明其操作步驟及在臨床科研中的應用

摘要 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用0ligo (dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使測的靈敏性提高了幾個數量級，使- - 些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

G. qpcr原理及應用

qpcr原理是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快，成為分子生物學診斷的主流。

應用行業：各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

由於qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白晶元等免疫學方法更具獨到優勢。

(7)QPCR的化學方法有哪些擴展閱讀

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標准曲線獲得定量結果。

因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。

2）Ct值與起始模板的線性關系由於Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標准曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種採用外標准曲線定量的方法。

外標准曲線的定量方法相比內標法是一種准確的、值得信賴的科學方法。利用外標准曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最准確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，葯物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

H. qPCR引物的純化方式

用HPLC純化方法。
由於qpcr屬於定量分析，必須要求引物純度高。所以必須用HPLC純化。
一般情況下,選擇PAGE,或者iPAGE(也叫TON)純化,這種純化方式的引物基本可以滿足常規分子生物學試驗,包括：PCR,qPCR,克隆擴增等等.價格還算親民,便宜.TON是最便宜的,所以也推薦這種方式.還有一種方式是HPLC.
使用於qPCR偵測的化學物基本可分為兩類：非專一性化學物通常是與DNA結合的螢光染劑；目標專一性化學物是使用螢光探針或引子。
非專一性偵測：SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)
目標專一性偵測：TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)。

I. 請問什麼叫QPCR

QPCR 問：什麼是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱QPCR。問：QPCR、DNA檢測、PCR之間的關系？答：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學獎。因其在病原體檢測方面的獨特優勢，因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快，成為分子生物學診斷的主流，至今仍處於學術和應用前沿：第一代產品：基因擴增熱循環儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構成PCR定性檢測。第二代產品：基因擴增熱循環儀+熒光儀+終點定量試劑，構成PCR-DNA終點法定量檢測（End-point quantitative PCR detection），又分為終點酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。第三代產品：實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑，構成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點？答：QPCR至少有以下特點：所用儀器少，只用一台儀器。檢測時間短，只須45分鍾～1小時10分鍾（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點定量須6～8小時，熒光終點定量須2～3小時。操作極其簡單：前處理後，樣本插入儀器一小時後到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。結果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由於只能在40個熱循環結束後檢測熒光，被測熒光達到飽和導致定量不夠精確，屬於半定量狀態。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續檢測各樣本的熒光值的變化，如圖一所示： 圖一 西安天隆TL988實際曲線1檢測動態范圍：10～10000000000 DNA copies/ml檢測精度：0.1RLU辨別率：5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7％。問：QPCR的技術先進性、價格及應用現狀？答：實時熒光QPCR是當今世界用於臨床的最先進核酸分子診斷技術，被美國FDA承認並推崇，被美國FDA批准並取得臨床應用執照的QPCR試劑品種有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性傳播疾病，沙眼衣原體，Neiserria gonorrhea(NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，Cytomegalovirus（CMV），性傳播疾病，巨細胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，結核分支桿菌等。實時熒光PCR儀研發技術難度大，門檻高，發達國家也只有有限幾家知名公司生產，且售價昂貴：如美國ABI/7700-120萬元，美國ABI/5700-50萬元，瑞士Roche/Lightcycler-70萬元，美國Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬元 可見，在病人看來，哪家醫院應用了QPCR技術便是先進診斷技術的象徵，在發達國家也是如此。 國產儀器情況：國產儀器生產單位不超過五家，其中包括：日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀（33孔）西安天隆科技有限公司TL988實時熒光QPCR儀（48孔） 以上產品均取得國家SFDA認證，報價均在45萬以上。 國產試劑情況：多家公司生產實時熒光QPCR試劑盒，價格與終點法試劑相當，且品種齊全，價格便宜，購買方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV，優生優育系列：巨細胞病毒CMV、弓形蟲COX等。 編輯詞條 開放分類：病毒、DNA、PCR、分子生物、實時熒光定量PCR儀 參考資料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 貢獻者：zhang120jing、弦之月NONO

J. 如何作QPCR的標准曲線

作QPCR的標准曲線可以用PCR－ELISA法作。

具體如下：

PCR－ELISA法：

利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；

再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。

常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標准曲線，也可實現定量檢測目的。

通過測定一系列已知組分的標准物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。

(10)QPCR的化學方法有哪些擴展閱讀：

實時熒光定量PCR技術，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。

檢測方法：

1、SYBRGreenⅠ法：

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號。

而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖、PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）。

2、TaqMan探針法：

探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；

PCR擴增時，Taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。

即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的預設（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15。

利用已知起始拷貝數的標准品可作出標准曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標准曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。