① 生物学重复必须同一时间去做吗
实验设计原则的正确把握：重复原则及其作用
重复原则通常有三层含义，即“重复取样”、“重复测量”和“重复实验”，实验设计中所讲的重复原则指的是“重复实验”。本文本文以实例的方式说明一下临床实验中违背重复原则和重复原则使用不当的常见情况。
重复原则及作用
重复原则的概念
重复通常有三层含义，即“重复取样”、“重复测量”和“重复实验”。从同一个样品中多次取样，测量某定量指标的数值，称为“重复取样”；对接受某种处理的个体，随着时间的推移，对其进行多次观测称为“重复测量”。实验设计中所讲的重复原则指的是“重复实验”，即在相同的实验条件下，做两次或两次以上的独立实验。这里的“独立”是指要用不同的个体或样品做实验，而不是在同一个体或样品上做多次实验。整个实验设计所包括的各组内重复实验次数之和，称为样本大小或样本含量。
重复原则的作用
同一个实验条件下为何要做多次独立的重复实验呢？只做一次不更节省时间柏费用吗？
关键在于观测的结果是否具有变异性，若对每一个正常人观测其有多少个手指，只需观测一个人即可，因为每个正常人的手指都有10个，它是一个不具有变异性的定量指标。若对每一个正常入观测其血小板的含量是多少，仅观测一个人就作出关于正常人血小板含量为多少的结论显然是可笑的，因为每个正常人血小板含量是不尽相同的。只有观测了大量正常人血小板的含量后，其取值规律性才有可能表现出来，初步的印象是取值接近该组被观测的全部受试者算术平均值的人较多，取值偏离此均值较远的人较少，取值特别小和特别大的人就吏少了。即便这样一种非常简单的规律，也只有在进行了大量重复实验之后才能够表现出来。
由此可如重复原则的作用就在于它有利于使随机变量的统计规律性充分地显露出来。
96孔板的实验，比如MTT，luciferase reporter等实验室，单次至少3个复孔，需要至少3次独立重复实验（肯定不是一天做的）。
WB实验，收样的时候可以不用做复孔，分装蛋白的时候可以分几份跑胶，也可以就跑一次。但是结果至少重复3次（三批的样本）保证重现性。
PCR实验，收样的时候不需要复孔，但是p的时候至少设置3个复孔，且至少3次独立重复实验，也就是说你等收三批以上的RNA样本。
染色实验，组织样本，至少来源于3只以上的动物，这个具体看你用什么模式生物，小鼠得6只，大鼠3只。每个组织至少有3-5张切片进行染色。最后分析的时候如果是扫描图片可以是一张整图，如果是放大的截取的图片，那至少观察5个以上的视野。细胞样本染色，6孔板或者比6孔板大的染色，我一般做1-2个复孔，其实一个也可以。96孔这种，至少也需要3个复孔.且都需要做3批以上。
CoIP, IP pulldown因为最后处理相当于WB,参考WB即可。
ChIP参考PCR即可。
RNA-seq, ChIP-seq,>3个重复样本。
注意：文章中的n=5，动物实验的话是指有5只动物，细胞实验是指5个独立实验，也就是5批实验的结果，不是5个复孔的意思。
② 2个生物学重复的荧光定量结果怎么分析 作图
ct mean,是你相同样品的几个重复的CT值得平均值如果是做的相对定量，用CTmean的结果就可以了，计算方法就是R＝2-ΔΔCt，现在很多仪器你只要设置的时候明确标出内参基因和目的基因，这个结果也是会有自带给计算出来的。如果你是做绝对定量，那更方便，你只要在仪器设置的时候把你的标准品含量依次输入，最后会自动生成标准曲线什么的，你最后只要分析og sq的结果就可以了。
③ WGBS测序深度和生物学重复知多少
转录水平的研究中设置多少生物学重复和测序深度比较合适？
生物学重复可以定义为使用来自不同抽提的样本进行实验，例如，上图中同一来源独立制备的3只老鼠。对每一个样本制备来说，只要抽提之后的步骤是独立进行的，那么分析测量就是独立的。虽然对于特定的基因，生物学重复的变异大于技术重复，但是由每一个独立样本引入的偏差通过取每一个测量的平均值几乎消除，因此生物学重复的实验结果易于广泛概括。通常，生物学重复用于概括性结论的验证，技术重复用于减少这些结论的变异性。这也是为啥高分文章需要更多生物学重复。具体两个例子说明下设置生物学重复的重要性：
案例1：Sequencingtechnology does not eliminate biological variability.
图说明：A plot of the expression for two genes COX4NB (left column, pink)and RASGRP1 (right column, blue) as measured with sequencing (top row) andmicroarrays (bottom row) versus biological sample. Mean-centered measurementsfrom the two studies are plotted as circles and triangles, respectively.
从图上看，测序和技术的结果一致性很好（其实测序和芯片技术各有优劣势，以后有机会再说）。COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。这结果意味着：不同实验组间COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。通俗点说，如果癌和癌旁的差异表达是“COX4NB”基因表达形式，那么很容易重复做出结果，而如果三对三筛选出“RASGRP1”的基因表达形式，那么你扩大样本验证就会出现和前期筛选不一致的结果。
案例2：GEO数据库下载两组数据的分析
下图是两组数据，癌（黄线左侧）和正常组织（黄线右侧）筛选的部分差异基因。如果选择3个重复如上方箭头标出的，这个基因就没有差异。如果选择4个重复如下方箭头标出的，这个基因就出现相反的变化水平。
作图软件源自微信公众号《实验万事屋》介绍的GENE-E
说了这么多，大家都知道实验设计中重复越多越好，但是具体多少比较合适，下面几篇文献供参考：
文献A. Howmany biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and whichdifferential expression tool should you use?
数据来源：RNA was sequenced from 48 biological replicate samples ofSaccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）in eachof two well-studied experimental conditions; wild-type (WT) and a Δsnf2mutant. Quality control and data processing steps rejectseveral replicates from each condition resulting in 42 WT and 44 Δsnf2biological replicates of “clean” data totaling ∼889M aligned reads.
这篇文章主要提出了2个问题：
1. 在RNA-Seq实验中需要多少生物学重复提高差异基因鉴定工作的准确性和灵敏度？
参考答案是：至少6个重复以上，12个以上更佳。至于你纠结6个重复怎么来的，请看下图:
2. 在一定重复数量的RNA-Seq中，用哪种统计算法或工具更合适？
参考答案是：.如果每组少于12个重复，相对的edgeR更优秀一些，如果超过12个重复，DESeq更佳。文章使用的统计算法如下表：
另外值得一提的是，这篇文章中的模式生物是酿酒酵母。我“网络”（别鄙视，没办法用google）了下，酿酒酵母菌属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆形或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。它的参考基因组如下:
至于你问我其他物种多少生物学重复合适，我只能说越多越好了。
文献B.Differential expression in RNA-seq: A matter of depth
④ 根据生物学重复,两个样本对应不上号应该怎么区分啊
你好，这是正常现象，我们可以去两个样本的平均值。
生物重复：指对同一个处理组中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型的多个细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除该差异。目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。发现生物重复是衡量实验的总波动的（处理组间的差异不列入此处的波动，他们应该称为效应），它包括样本个体间差异和技术重复差异。
⑤ 宏基因组测序对样品的生物学重复有什么要求如何避免重复性较差的问题出现
土壤、水体等生态环境样本建议5个或5个以上的生物学重复；取样时每个样品均需多点取样后混匀，降低单个样本特异性。
人和动物样本因个体特异性较大，建议10个以上生物学重复；肠道、瘤胃或粪便样本因含有较多厌氧菌，要快速取样、迅速低温保存，针对较难富集微生物的样品，如各种物体表面，可采用缓冲液洗脱或棉签擦拭等方法。
样品取好后避免长时间放置，需尽快进行DNA提取，送样测序。
⑥ 物理重复和生物学重复都必须要吗
可以都要
如果你的高通量的数据是要放到文章里面去的，甚至有人仅仅芯片的数据就发一篇文章，那一定要有n>=3的生物学重复。如果只是自己看一看，找个方向，那可以不做重复。但是，问题来了，如果是组织样，组内差异很大，不做重复也没意义。如果是细胞株，可能好一些。生物学重复是必要的，就是样本和总体的关系，样本越大越能代表总体
⑦ RNA-seq没有生物学重复 被审稿人argue怎么办
一般一篇RNA-seq类的文章，其结论主要涉及两个方面的问题。对于文章中结论中涉及的具体与某个性状相关的基因，还是建议你把与结论重要的相关基因使用Qpcr验证一遍，然后就有底气回复了：“虽然没有重复，Qpcr的结果支持我的关注的这些基因嘛”。（比如我们之前就分享了一篇大牛的文章，只有2个重复的lncRNA，通过多种后期实验验证发了8分的文章，戳这里查看）如果你的文章重点讨论的是某些通路或一类基因集合，全部Qpcr验证一遍工作量太大，不现实啊。
还有一个办法，去数据库查找类似的研究数据来支持我们的结论。例如，华南农大周碧燕教授今年刚刚发表的研究超氧化物对荔枝退化叶影响的文章（查看文献解读戳这里~）。虽然设计了重复，审稿人依然不过瘾：能不能再找些证据？在和周教授协商后，我们从NCBI下载了一篇研究超氧化物对拟南芥影响的文章的数据。在进行分析比较后，我们发现拟南芥差异表达基因几乎在荔枝的差异基因中都能找到同源基因。于是，审稿人就再也不提这个问题了。如果是医学类的项目，找到同类数据应该理论上也更加容易。
当然，如果要发表5分以上的文章，建议还是设置生物学重复比较保险一些。以上的策略，也只能保证能够应答大部分审稿人的质疑，但有时候也会遇到死揪不放的审稿人。那么，额，还是撤稿换投吧，说不定知音就在下一家杂志社哟。
⑧ 如何来设定转录组测序中的生物学重复
如何来设定转录组测序中的生物学重复
1.区分生物学重复与技术重复
生物学重复：指样本重复，比如3只小鼠，同时做一种处理，就是三个生物学重复。
技术重复：一般是三次实验，比如对一块组织，提了三次RNA，做三次real time。
2.设置生物学重复的意义
由于新一代测序技术的优越性以及高成本，曾一度忽略了“生物学重复”的重要性。但生物学重复对于测序实验的设计以及实验数据的解读和分析都非常重要。
设置生物学重复：
能够消除组内误差：生物学重复可以测量变异程度
增强结果的可靠性：测序的样本数越多，越能够降低背景差异
检测离群样本：异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。
案例一：
注：COX4NB和RASGRP1基因在生物学重复样本中表达值的散点图：
左边红色，COX4NB基因表达值的散点图
右边蓝色，RASGRP1基因达值的散点图
上面一行，测序数据的散点图
下面一行：芯片数据的散点图
COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。结果意味着：不同实验组间 COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。
由此可知，设计的实验如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果；获得的差异表达的基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征。
3.生物学重复设置几个合适？
您是不是有同样的问题：转录组测序是否必须进行生物学重复啊，是否要3个重复，是否可以用3个样品的RNA等量混合代替生物学重复，如果不重复能否发文章…..？一方面是有限的经费，一方面是编辑的质疑；实在很难抉择呀~~~
目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。文章投出之后，遭编辑质疑。那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验，FISH荧光原位杂交，或者是northern 杂交等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，然而考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。
注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取了平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。
4.生物学重复分析结果展示
以公司做项目的经验来看，原核生物以及真菌生物学重复的效果>植物>动物，这是由于动植物个体差异较大所导致。所以动植物在选取生物学重复时，应按照严格的筛选条件进行取样，方可得到理想结果。
⑨ 生物医学研究中的重复性，可以理解为下述哪些项
那么这只能是一个站不住脚的生物实验原则中可重复性原则怎么理解我认为生物学实验的可重复性并不差。原则上, Nature。 如果一个实验结果，片面的实验，需要特定的人在特定的时间和地点来重复。 但是，几乎一切现象都可以套用因果关系来解释。只要因果关系是成立的，那么实验就应该是可重复的，这个数据的权威性就要受到质疑。因果关系没有搞清楚，能够发表的数据。重复不出来只有两种可能，即使是CNS级别（Cell, Science三大期刊）的文章，要么操作有问题，也会有很多实验结果是重复不出来的，都应该是可以重复的，要么数据是不成立的。当我们纯粹的谈论科学时