如何鉴别纤维素酶微生物

A. 如何分离土壤中的产纤维素酶的微生物

土样破碎，无菌水冲悬，低速离心取上清，梯度稀释，平板涂布，挑单菌落液体培养，并在平板上画线培养（菌落较单一的话可以省略），在画方格的纤维素平板上挑单菌落培养，挑水解圈的菌落液体培养，利用滤纸条鉴定水解能力，做生长曲线，优化培养条件。要做鉴定的话就是看菌落形态，理化性质，16s测序做进化树……自然界中蕴藏着巨大的微生物资源，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。土壤和海水这两大类资源宝库的开发具有重要意义。我们可以从土壤、腐木筛选相应的产酶微生物，从污水中筛选各种能够产生分解糖类、脂类、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香物质有机磷农药、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在极端环境可筛选嗜热微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、耐高压微生物等，并开发极端微生物酶品种。进21世纪以来，各国已在生物产业研究中投入了巨大的财力和科研力量。随着能源、资源和环境问题的日趋严重，生物资源利用已被全球广泛重视，成为世界各国的战略性研究重点。在自然界中，纤维素类物质是最廉价、最丰富的一类可再生资源，是人类社会赖以生存的基本物质来源。全世界植物体生成量每年高达1 500亿t干物质，其中有50%以上为纤维素和半纤维素。采用生物酶催化技术可将农作物、树木和其他植物及其残体、畜禽粪便、有机废弃物等生物质转化为工业原料，达到合理、可循环利用自然生物资源的目的。担子菌亚门Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycets)和子囊菌亚门(Ascomycotina)的部分真菌都具有很强的产生纤维素酶和漆酶的能力，备受生化工业领域的关注。其中，白腐菌、褐腐菌和软腐菌是自然界中降解木材的主要真菌。在过去的30多年里，有关白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有关软腐菌的研究则集中在纤维素降解酶系方面；而有关褐腐菌的研究主要集中在降解木质纤维素机制方面。

B. 鉴别培养基怎么鉴别分解纤维素的微生物

先明晰一下概念：
鉴别培养基

      是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他中微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。
鉴别分解纤维素的细菌，就用纤维素作为唯一碳源，并在培养基中加入刚果红。作用如下：
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种燃料，他可与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的产物如纤维二糖或葡萄糖发生这种显色反应，当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素分解菌分泌的纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

C. 如何比较两株微生物长纤维素酶能力的强弱

用以可溶性纤维素这唯一碳源的平板比较。
做同样的平板，都以可溶性纤维素为唯一碳源，接种两种微生物，培养观察。
培养24－48小时后，因微生物产生纤维素酶分解纤维素，会在菌落边缘出现透明圈，产酶能力越强，透明圈的直径越大。
以此方法来比较。

D. 鉴定纤维素分解菌时，怎样利用透明圈判断

由图可知，纤维素分解菌产生的纤维素酶将鉴别培养基中的红色复合物中纤维素分解后，红色就消失了，出现透明圈，菌落周围红色消失有透明圈的菌体初步筛选为纤维素分解菌。

E. 请问下鉴别分解纤维素菌的时候，刚果红要加多少啊还有采用什么纤维素呢，普通的做薄层的可以么

鉴别纤维素分解菌用纤维素刚果红琼脂平板，刚果红浓度0.2-0.4g/L，纤维素一般用羧甲基纤维素钠（CMC-Na），可以在配制培养基时加刚果红，培养后显示降解圈。也可以配制培养基时不加，等菌落长出后用1g/L的刚果红覆盖菌落染色30mins，用1mol/L的氯化钠脱色30mins，显示降解圈。

F. 筛选纤维素分解酶的方法

（1）纤维素酶是一种复合酶，包括C ₁ 酶、C _X 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖．纤维素分解菌可以用刚果红染液进行鉴别，刚果红可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，能够产生透明圈的菌落就是纤维素分解菌．因此，刚果红染色法能通过颜色反应直接对微生物进行筛选．
（2）为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验．纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种．
（3）进行菌种保藏时，若采用临时保藏，将菌种接种在斜面培养基上，放人4℃冰箱中可保藏3～6个月；若要长期保存，可将菌液与灭菌的甘油混匀，放在-20℃的冰箱中保存一年．
故答案为：
（1）复合 葡萄糖
（2）刚果红染色法 液体发酵 固体发酵
（3）将菌种接种在斜面培养基上，放人4℃冰箱中 将菌液与灭菌的甘油混匀，放在-20℃的冰箱中

G. 刚果红染色法鉴定纤维素分解菌的方法一会不会出现能产生假阳性反应的产淀粉酶菌

会。

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 。这样可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应，有些微生物具有降解色素的能力，在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。

(7)如何鉴别纤维素酶微生物扩展阅读：

注意事项：

1、用于定性组织学染色，有选择性地使福尔马林固定、石蜡包埋组织中的淀粉体显色。

2、产品有效期：2-8℃，12个月。附件：注册产品标准，产品说明书。

3、切片脱蜡应尽量干净，否则影响染色效果。

4、刚果红染色液染色时尽量采用浸染，如果滴染，应置于湿盒防止溶液挥发。

5、分化时间较短，胶原纤维也被染成红色，分化过度，淀粉样物质也被脱色。如果脱 色过度，可以将切片清洗后重新用刚果红染色液浸染。

6、为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

H. 刚果红培养基鉴别产纤维素酶菌的原理是什么（尽量说细致一点，主要是反应机理方面的。）

纤维素酶真菌和不产纤维素酶阴性对照菌毛霉在纤维素-刚果红培养基中刚果红染料移动，刚果红染料进入产纤维素酶真菌，产纤维素酶真菌首先分解纤维素物质为含有葡聚糖等结构的多聚糖类物质，多聚糖与刚果红形成多聚糖-刚果红复合物，复合物不仅被吸附在菌丝外，而且能被进一步转运吸收至菌丝内部。通过进一步的降解，多聚糖被分解而加以利用，而刚果红则被保留在菌丝体内，使菌落呈现红色。所以，纤维素-刚果红培养基可作为分离、筛选纤维素分解真菌的特异性培养基。

I. 鉴别纤维素分解菌采用什么染色法

1、刚果红能给纤维素染色，第一种方法是在菌落长出来以后加的刚果红，产纤维素酶的菌落周围的纤维素被水解了，因此染色较浅或没有被染色，从而分辨出产纤维素酶的菌落；而第二种方法是在培养基中直接加入刚果红，因为培养基中有淀粉物质的存在，产淀粉酶的菌落在水解淀粉的同时可能会使刚果红的染色变浅，出现水解圈，即假阳性现象。
2、是在培养基中加入刚果红。

J. 对纯化的纤维素分解菌采用什么方法进行鉴定

先明晰一下概念：鉴别培养基 是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他中微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。鉴别分解纤维素的细菌，就用纤维素作为唯一碳源，并在培养基中加入刚果红。作用如下：刚果红（CongoRed,简称CR）是一种燃料，他可与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的产物如纤维二糖或葡萄糖发生这种显色反应，当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素分解菌分泌的纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。