如何筛选能高效降解石油的微生物

❶ 如何设计筛选高效降解某种有机物的微生物实验方案

生物降解是指由生物催化的复杂化合物的分解过程。而在石油降解中微生物首先通过自身的代谢产生分解酶，裂解重质的烃类和原油，降低石油的粘度。

另外在其生长繁殖过程中，能产生诸如溶剂、酸类、气体、表面活性剂和生物聚合物等有效化合物利于驱油，然后由其他的微生物进一步的氧化分解成为小分子而达到降解的目的。

注意事项：

海洋中最主要的降解细菌属于：无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、假单胞菌属以及放线菌属、诺卡氏菌属。在大多海洋环境中，上述这些细菌是主要降解菌。

在真菌中，金色担子菌属、假丝酵母属、红酵母属和掷孢酵母属是最普遍的海洋石油烃降解菌。一些丝状真菌如曲霉属、毛霉属、镰刀霉属和青霉属也应被归入海洋降解菌中。土壤中主要的降解菌除了上面提到的细菌种类外，还包括分枝杆菌属以及大量丝状真菌。曲霉属和青霉属某些种在海洋和土壤两种环境中都有分布。木霉属和被孢霉属某些种是土壤降解菌。

❷ 如何利用微生物勘探石油和提高采油量

微生物采油对低产、枯竭油田特别有吸引力，能提高采收率。

4
、不污染环境

微生物采油技术不污染环境，不损害油地层，可在同一油藏区或同一油井中反复使用。

（三）采油微生物的生物学特性

用于油田开采的微生物一般具有以下鲜明的生物学特征：

1
、厌氧或兼性厌氧。在地层无氧条件下能生长繁殖并进行厌氧发酵，在地上有氧条件下也
能生长繁殖。

2
、在油层高温、高压、高盐等极端环境下能生长繁殖并代谢。

3
、多数采油微生物能以烃类作碳源，能以贮油层

内的无机盐作氮源或作营养元素。

4
、采油微生物必须与其注入油层的环境条件相配伍相适应，要在油层内能运移，能生长繁
殖，能产生有机酸、气体、表面活性物质、生物聚合物、有机溶剂等多种代谢产物。能在
50°
以上的温度及缺氧条件下生长的中度嗜盐细菌，是微生物采油中最常用的菌种。

（四）微生物采油技术

微生物采油技术是指将筛选的微生物或微生物代谢产物注入油藏，
经微生物的代谢活动
和产生的代谢产物，
作用于原油，
改变原油的某些物理化学特性，
从而提高原油采收率的技
术。

根据实施过程与方法的不同，
微生物采油技术可分为地上微生物采油技术和地下微生物
采油技术。

1
、地上微生物采油技术

地上微生物采油技术是指在地上通过微生物发酵、生产微生物的某种代谢产物，如生物
多糖聚合物或生物表面活性剂，
然后将发酵产品注入油藏而提高原油采收率。
该技术的实质
是利用选育的优

良菌种在地上发酵生产采油制剂的技术。

目前，地上微生物采油技术主要是在地上发酵生产采油中广泛应用微生物多糖和微生物
表面活性剂。

（
1
）微生物多糖

据研究，
有百种以上的微生物能产生结构、
性能各异的胞外多糖。
能产胞外多糖的主要
微生物类群是：明串珠菌属、黄单胞菌属、固氮菌属和小核菌属等。

采油工业中应用最广泛的微生物多糖是：
肠膜明串珠菌或葡聚糖明串珠菌产生的右旋糖
酐葡聚糖、
普鲁兰出芽短梗霉产生的普鲁兰糖、
齐整小核菌或葡聚糖小核菌产生的小核菌葡
聚糖。采油中最具开发应用潜力的是野油菜黄单胞菌产生的胞外多糖黄原胶。

（
2
）微生物表面活性剂与乳化剂

以烃为碳源的微生物是生物表面活性剂的重要来源。
因为石油微生物必须分泌表面活性
剂，才能促使烃与水乳化。烃只有均匀地分散在水中，才能被石油微生物吸收利用。所以石
油微生物是表面活性剂最丰富的基因库。

假单胞菌属、节杆菌属、不动杆菌属和棒杆菌属等是产生生物表面活性剂

的主要微生
物类群。微生物产生的生物表面活性剂就其化学组成来分，主要可分为糖脂类和脂肽类

。
分子的极性端或是多羟基的糖类或是氨基酸类，
非极性端是长链脂肪酸的长链烃部分。
微生
物表面活性剂的粗制品或纯品注入贮油岩层，
作用于油一岩石一水三相体系，
降低油水界面
张力，增强油水乳化，提高原油采收率。

2
、地下微生物采油技术

地下微生物采油（
MEOR
）技术是指将在地上模拟油藏条件筛选的微生物菌种与营养物
注入油藏，
微生物在油藏中运移，生长繁殖，
产生多种代谢产物，
作用于原油而提高原油采
收率；
或用生长繁殖的菌体细胞及代谢产物封堵贮油岩层大的孔道，
调整水驱油剖面；
或只
将营养物注入油藏，激活油藏内的原生微生物，靠其生命活动提高原油采收率。

根据单井增产措施的处理方法和提高原油采油率的要求，地下微生物采油可分为
6
类：

（
1
）单井周期注人微生物采油

为提高低产油井的原油日产量，
在油井高压注入采油微生物，
关井，
使微生物运移到油
井周围直径
10m
左右的贮油岩层，经微生物的生命活动，疏通被堵塞的油层空隙通道，增
加原油的流动性，提高原油采收率。
为了保持高产，需要不间断地、周期性地注入采油微生
物。

（
2
）微生物驱油

采油微生物从注水井注入油层，
微生物随注水向油井贮油层深部移动，
同时进行生长繁
殖，并产生多种代谢产物。细胞和代谢产物综合作用于原油，降低黏度，增加原油流动性，
提高原油采收率。

（
3
）激活油藏微生物群落驱油

油藏中存在着天然的微生物群落，
但由于营养物质贫乏，
数量很少。
从注水井将营养物
注入油层，激活天然微生物群落，让其生长繁殖，产生多种代谢产物驱油。

（
4
）微生物选择性封堵

将体形较大且产生表面黏稠物质的微生物菌种从注水井注入，
运移到大孔道或有溶洞的
贮油岩层部位，用生长繁殖的大菌体细胞和表面黏稠物质形成的生物膜封堵大孔道或溶洞，
防止注入水
“
指状
”
流动，提高原油采收率。

（
5
）微生物压裂液压裂

将厌氧条件下大量产生有机酸的微生物及营养物注入空隙度甚小、渗透率很低的贮油
层，在高压下用有机酸溶解岩层使之形成缝隙，有利于原油流动，提高原油采收率。

（
6
）微生物油井清蜡

原油中含蜡量较高，
会析出蜡晶固着在井壁，
堵塞贮油层通往井壁的空隙通道，
降低原
油流动性，
减少单井原油日产量。
注入产生表面活性剂或溶剂的采油微生物，
用其代谢产物
表面活性剂、乳化剂清洗井壁，溶解固形石蜡，提高原油采收率。

（五）微生物在石油污染中的生物修复作用

1
降解石油的微生物种类及分布

据目前的研究
,
能降解石油的微生物有
70
个属
,
其中
28
个属细菌
, 30
个属丝状真菌
, 12
个属酵母
,
共
200
多种微生物。海洋中最主要的降解细菌有：无色杆菌属
(Achromobacter)
、
不
动
杆
菌
属

(Acinetobacter)
、
产
碱
杆
菌
属
(Alcaligenes)
等
;
真
菌
中
有
金
色
担
子
菌
属
(Aureobasidium)
、假丝酵母属
(Candida)
等。石油降解菌通常生长在油水界面上
,
而不是油液
中。据丁美丽等
[5]
在胶州湾的实验证明
,
胶州湾的石油降解菌在表层水体中的最高值可达

4.6×
102
个
/mL
。

石油降解菌数量仅与海水的石油污染情况有关。
石油降解微生物的种类和
数量对海洋中石油的降解有明显的影响。
一般情况下
,
混合培养的微生物对石油的降解比纯
培养的微生物快
,
但是崔俊华等在实验中筛选出了
7
株高效原油降解菌。

2
石油降解菌的作用

（
1
）作为油污染的生物指示

以往大多数调查结果表明
,
在海洋中石油烃降解细菌的数量或种群与水域受到油类物
质污染的程度有密切关系
,
通常在被油污染的水域中
,
石油烃降解细菌的数量明显地高于非
油污染的水域。

烃类降解菌数和异养细菌数的比值能在一定程度上反映水域受油污染的状
况。

丁美丽等在胶州湾的工作以及史君贤等在浙江省海岛海域的工作都证明了这一点。石
油污染可以诱导石油降解菌的增殖及生长
,
Atlas
报道在正常环境下降解菌一般只占微生物
群落的

1%,
而当环境受到石油污染时
,
降解菌比例可提高到
10%
。说明石油污染可以使降
解菌发生富集
,
降解菌可以作为石油污染的生物指示。

（
2
）通过自身代谢作用降解石油

向水体中投加菌种净化水体的技术是从清除海洋石油污染开始的。
实验室研究表明
,
单
一菌剂除油率为

20%
～
50%,
而混合菌剂除油率可达

71.4%
。
丁明宇等
[8]
从青岛近海海水中
分离、

筛选到

73
株细菌和

10
株真菌
,
并对其降解石油的能力进行了研究
,
结果表明
,
多
数菌具有明显的降解石油的能力
,
其中
,
有

3
个菌株对石油的生物降解率分别高达
58.35%
、

62.75%
、

71.06%
。史君贤等
[9]
在浙江沿海海水中分离石油烃降解细菌
,
并实验
证明降解菌对正烷烃有明显的降解作用
,
混合菌株的降解率明显高于单菌株的降解率。在
20
℃的条件下
,
经过

21d
后
,
绝大部分的正烷烃被降解
,
总的降解率为

94.93%,
其中细菌
的降解率为

75.67%,
理化降解率为
19.26%
。在实施接种的现场生物修复处理中
, 1990
年在
墨西哥湾和

1991
年在得克萨斯海岸都获得了成功
,
现场观察表明
,
在开放水体中添加降解
菌是有效的。

（
3
）合成生物表面活性剂
,
加速石油的降解

生物表面活性剂
(Biosurfactants,
简称

BS)
是细菌、

真菌和酵母在某一特定条件下
(
如合
适的碳源、

氮源、

有机营养物、

pH
值以及温度
) ,
在其生长过程中分泌出的具有表面活

性的代谢产物。
生物表面活性剂可以强化生物修复
,
它能将烃类物质乳化
,
进而促进其降解
,
尤其适合处理海上溢油。
Chabrabarty
曾报道
,
由

Pscndomona
acruginosa
(
铜绿假单胞菌
)
生成的一种生物表面活性剂
(
海藻糖酯
)
由于能有效地将石油分散成水液滴
,
因而可促进石油
污染海岸的生物修复
,
大大提高了

Exxon
Valdez
原油泄漏造成的阿拉斯加污染区域石油烃
的降解速度。

（
4
）基因工程菌

基因工程菌是将不同细菌的降解基因进行重组
,
将分属于不同细菌个体中的污染物代
谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌
,
可以有效地提高微生物的降解能
力
,
从而提高生物修复效果。

通常石油降解菌只能降解某一种石油成分
,
并且由于石油的种类不同
,
所需降解菌也不
相同
,
天然环境中存在的石油降解菌不能高效地降解多种石油成分
,
使基因工程菌的出现成
为必然。同时
,
复杂的烃类化合物混合物的降解需要有混合菌株的参与
,
但不同菌株之间可
能会产生竞争或拮抗作用
,
从而对降解产生负面影响。使用基因工程菌可以避免此类问题。

目前
,
已有人在实验室条件下获得基因工程菌并在实验室取得满意的降解效果。
例如美
国的

Chakrabaty
等使用具有

CAM
、

OCT
、

XAL
和

NAH4
种降解质粒的

“
多质粒超级
菌
”
,
可以使海上浮油在几个小时内降解
,
而在自然条件下这些浮油需要

1a
时间才能被降
解。这项技术取得了美国的专利权。但是考虑到在开放环境中使用基因工程菌的安全问题
,
目前基因工程菌的使用仅限于实验室
,
尚不能大规模使用。

另外
,
目前在研制基因工程菌时
,
都采用给细胞增加某些遗传缺陷的方法或是使用携带一段
“
自杀基因
”
,
使该工程菌。在非
指定底物或非指定环境中不易生存或发生降解作用。

3
微生物降解石油的方式

石油烃化合物可分为

4
类
:
饱和烃、

芳香族烃类化合物、树脂及沥青质。其中
,
短链
的饱和烃在溢油发生初期通过挥发等作用进入大气
,
其他的石油烃中
,
饱和正烷烃最易降解
,
其次是分支烷烃
,
再次是低分子量芳香烃
,
多环芳烃很难降解
,
树脂和沥青质极难被降解。

直链烷烃的降解方式主要有

3
种
:
末端氧化、

亚末端氧化和氧化。
芳香烃在好氧条件
下先被转化为儿茶酚或其衍生物
,
然后再进一步被降解。
高分子量多环芳烃降解菌报道很少
,
许多四环或多环高分子量多环芳烃的降解是以共代谢
(Cometabolism)
的方式进行的。但是共
代谢完全是间接或偶然的事件
,
并且风险较大
,
可能会产生比母体毒性更大的化学物质。

树
脂和沥青质极难被降解
,
但是有报道称
,
有着复杂构造的树脂和沥青质也能受到某种程度的
分解
[14]
。

冷凯良等的实验表明
,
微生物降解原油代谢产物主要是乙酸和棕榈酸为主的脂肪酸与
鼠李糖形成的糖脂类表面活性剂。

4
石油降解菌的获得

由于天然海洋环境中石油降解菌数量较少
,
一旦发生溢油
,
不能及时对石油进行降解
,
所以
在溢油发生后一般要向环境中添加石油降解菌以保证石油的高效降解
,
但是考虑到安全等
方面的问题
,
菌种不能盲目投加。

一般来说
,
可以把取自自然界的微生物
,
经人工培养后再
投入到污染环境中去治理污染。

具体到海洋石油降解菌的获得
,
一般为
:
首先选择油污染环
境
,
从中分离出适应性菌株
,
并将其中的石油降解菌富集培养
,
通过反复适应和驯化或遗传
修饰进行进一步筛选
,
从而培养出高效降解的菌株
,
将其进一步繁殖后投加至受污染环境中
或分类保存。

根据微生物与石油的作用机制
,
选择高效降解微生物的标准包括：

( 1)
对石油有较高的耐性。

( 2)
对海洋环境的适应性较强。

( 3)
对石油的降解效率高
,
专一性强。

( 4)
不影响海洋环境中原有的生物多样性。

虽然微生物修复主要是依靠微生物的降解能力降解污染物
,
但是微生物对污染物的分
解、转化也是需要条件的
,
所以除了投加高效降解菌之外
,
还要为这些降解菌创造必要的生
存、

降解条件。这样才能有效地进行石油污染修复。

5
影响微生物降解石油污染物的因素

微生物在降解石油污染物的过程会受到营养元素、表面活性剂、
O
2
通量、温度、
pH
值
等外界因素的影响。其中
,
营养元素对降解率的影响较大，尤其是
N
、
P
元素。
何良菊等专门
对石油烃微生物降解的营养平衡进行了研究，
表明氮、
磷营养物质的缺乏直接限制了石油烃
的微生物降解
,
但添加过量反而有抑制作用
,
因而存在一个经济合理的添加量及添加比例，实
验表明氮磷比在
5
∶
1~6
∶
1
比较适宜，
,
无机氮源比有机氮源好，硝酸盐形式的氮比铵态的
氮更合适。而国内有其他研究却更倾向于氮磷比为
1
：
1
，且最佳氮源为氯化铵，最佳磷源
为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。两种研究得出的结果不一致。

表面活性剂是影响降解效率的又一重要因素。表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和
分散作用，
从而对石油降解菌的降解效率有重要作用，
而有研究则指出表面活性剂对微生物
存在一定毒害作用。
刘庆新等通过研究，
表明表面活性剂的加量多少对石油烃降解菌的影响
比较复杂：
加少量的表面活性剂会促进石油烃降解菌的生长，
但随着表面活性剂加量的增加
,
菌量反而减少，证实了上述论断。

在自然环境中，大多数的石油烃类是在好氧条件下被降解的，但是微生物对石油烃的
降解在有氧及缺氧两种情况下都会进行，
最近有研究表明厌氧降解对饱和烃及芳香烃有着极
为重要的作用。

能降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜热菌和嗜中温菌，因此在温度低于
0
℃和在
70
℃左
右的环境中均有能降解石油的微生物，大多数石油降解菌属嗜中温菌，最适温度在
30
℃上
下，温度过高过低都会对降解效率产生抑制。

普遍认为石油降解菌是产酸菌，且适宜生长于中碱性环境中。刘庆新等研究得最佳
pH
值为
8.0
，而其文章中也指出与一般认为的
7.0
不符。而
Stapleton
[20]
等发现在
pH 2.0
的一处
土样中，萘和甲苯仍然被降解为
CO
2
和
H
2
O
。

6
生物降解石油烃污染物的应用

利用生物降解石油烃类污染物最早见于
20
世纪

80
年代末美国在

Exxon
Vadez
油轮
石油泄露的生物修复项目中，
该项目在短时间内清除了污染，
治理了环境，
是生物修复成功
应用的开端，同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用。
20
世纪
90
年代以来，生物
修复技术在石油污染治理方面逐渐成为核心，
取得了理论突破和重要成果。
国内学者也做了
大量工作，但主要为石油污染土壤和地下水的生物修复研究
[38]
，对海洋石油污染的生物修
复研究相对较少，
而且研究工作也大多停留在实验室模拟实验的水平上。
闫毓霞利用土着微
生物对胜利油田含油污泥进行修复实验；黄廷林等
[40]
对黄土地区石油污染土壤进行了室内
模拟生物修复研究。

石油降解菌在实际应用中存在着很多问题，集中表现在投加高效石油降解菌来处理污
染时：投加菌面临与土着微生物的竞争作用；投加菌需要适应新的生长环境；

投加菌要经
受环境污染物的毒性影响。这些压力使接种的外源微生物的存活率很低或者活性较弱
,
限制
了它的实际应用。

7
展望

石油降解菌降解石油烃类污染物具有物理、化学方法所不具备的优点，它高效、经济、
安全、
无二次污染，
在机械装置无法清除的薄油层而且化学药剂被限制使用时，
生物法处理
溢油的优越性便更加显着，
具有广阔的研究及应用前景。
目前国内外对石油降解菌的研究呈
现出一定特点：

(1)
对一般性降解菌研究多，对极端环境下的石油降解微生物研究少，尤其是对低温、
耐盐的石油降解菌。中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，常年气温（尤其冬季）气温
较低，
而无论是来源海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。
在这种条件下的石油降解
菌研究具有很广阔的前景。

(2)
对石油降解菌的研究多而应用少。
对石油降解菌的所有研究到最终肯定要归结到实
际应用中去，
目前国内很多学者都对石油降解菌的单纯研究感兴趣，
同时出现了大量的重复
研究。国外已有成功应用先例，证明石油降解菌可以用来修复实际污染，国内仍止步不前，
难于踏出实际应用的第一步。

随着大量学者的不断研究，对石油降解菌的认识肯定会不断深化，其应用也会逐渐成熟

❸ 为什么要密封培养能降解石油的微生物

（1）在长期被石油污染的土壤中生存下来的微生物，能降解石油，所以土壤取样时，应从含石油多的土壤中采集．
（2）筛选和纯化该类微生物，应选用以石油作为微生物生长的唯一碳源的选择培养基．
（3）该类微生物是厌氧微生物，接种后应密封培养；培养一段时间后在培养基上可形成降油圈，降油圈越大，说明该处的微生物降解石油的能力越强，所以应选择降油圈大的菌落进行培养以获得高效菌株．
故答案为：
（1）长期被石油污染（含石油多的）
（2）石油作为微生物生长的唯一碳源
（3）厌氧型 降油圈大的菌落

❹ 处理石油的微生物有哪几种墨西哥石油泄漏，英国石油公司采取的方法

用于脱硫的微生物及脱硫机理
已从炼油厂污水处理的活性污泥、煤焦油污染的或煤矿附近的土壤、温泉、实验室培养菌中筛选分离出一些可用于脱硫的微生物，其中大多数微生物对脱除无机硫及非杂环硫较有效，对杂环硫的脱除效果甚微. 少数可脱杂环中有机硫的微生物有两种氧化方式: C-C键断裂氧化和C-S键断裂氧化. 在前一途径中, DBT的一个芳香环被氧化降解, 杂环硫不从环中脱除, 而是生成水溶性3-羟基-2-醛基-苯噻吩除去, 导致烃燃烧值降低. 而在后一途径中杂环硫被脱出但不引起芳香环碳骨架的断裂, 这是一个较为理想的途径，因此受到重视.
脱除无机硫的微生物主要是化能自养菌属Thiobacillus sp.以及嗜热硫化裂片菌属Sulfolobus sp.中的一些菌. 这些菌氧化无机硫化物有间接作用和直接作用两种作用机理. 间接作用机理为细菌氧化溶解Fe2+，生成的强氧化剂Fe3+再将硫化物氧化生成S0，然后Fe2+又被氧化，沉积在煤和石油中的硫再被Fe3+氧化生成水溶性硫酸盐. 直接氧化的机理则为细菌直接与硫化物的含硫部位接触, 在细菌生物膜内作用生成还原性谷光甘肽(GSH)的二硫衍生物GSSH，GSSH被一氧化酶氧化并水解成亚硫酸盐，亚硫酸盐又被氧化为硫酸盐，生成的还原性辅酶被细胞色素氧化还原剂中的溶解氧再氧化. 细菌的直接作用着重于还原性硫的酶氧化. 这两种途径作用的产物都是水溶性的，因此，脱硫的同时也脱除了燃料中的金属.
研究较多的脱有机硫菌有以有机硫化物(主要是DBT)作为碳源断C-C键的Pseudomonas sp.和Brevibacterium sp.菌，还有以DBT作为唯一硫源的专一性断CS键的Rhodococcus Strain, Sulfolobus Scidocaldarius., Desulfovibrio desulfuricans M6及Corynebacterium sp.菌\. 微生物脱有机硫有两种途径，由于中间产物和终产物的不同，C-S键专一断裂途径中又可能存在三个不同序列.

参考资料： 石油和煤微生物脱硫技术的研究进展 姜成英, 王蓉, 刘会洲, 陈家镛 石油生物催化脱硫技术是采用微生物体内的酶来催化氧化油品中的有机硫，使之转化为水溶性硫化物加以除去，从而实现生物催化脱硫。
该技术在美国已实现了工业化，与加氢脱硫技术相比其设备投资低50%，操作费用降低15%。

❺ 如何用牛肉膏蛋白胨培养基筛选,分离一种能降解石油的细菌,你认为应如何做

石油的成分太复杂了。不过里面大部分是有机成分，碳源氮源都有，如果筛选的话你应该可以选出来很多。因为不同的菌可能会利用石油里面的不同物质。如果想筛选的话可以按照以下步骤。

1. 配制固体培养基：成分为基本无机营养盐，琼脂（高级点的，里面不能有杂质）， 加一定浓度的灭过菌的石油。倒平板。这个平板上碳源氮源都只是石油，所以是选择培养基。

2. 取1mL石油，稀释10，100，1000，10000倍，每种稀释液取100uL涂平板。一个做三个重复，看看有没有东西长出来。

3. 有长出来的话，根据形态观察，挑选不同的再分别继续涂在平板上纯化，分离。

补充：结果是你可能会得到非常多的细菌。。。先去网上搜一下已有的文献吧，别直接动手。实验设计比做实验更重要。

❻ 研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解石油的细菌．为了分离和纯化高效分解石油的细菌，

（1）培养基灭菌突触使用用高压蒸汽灭菌，为筛选出能分解石油的细菌，所以石油是唯一碳源．
（2）接种细菌常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法．图B为平板划线法，如图甲所示．
（3）步骤⑤进一步操作是为筛选出分解石油能力最好的细菌，微生物计数可用稀释涂布平板法和血球计数板计数法．
故答案为：
（1）高压蒸汽灭菌 石油是唯一碳源
（2）平板划线法和稀释涂布平板法甲
（3）筛选出分解石油能力最好的细菌稀释涂布平板法 显微镜直接计数（血球计数板计数法） 血细胞计数板（血球计数板）

❼ 运用所学的微生物学知识谈谈如何从环境中分离能降解硝基苯(或石油)的细菌

用硝基苯（石油）加水做培养基，能够在上面生长的微生物就有可能降解硝基苯（石油），把这些微生物再分离，分类，纯化，分别实验，最终分离出有用的微生物。

❽ 功能微生物筛选过程及应用价值

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 ? {cF'RB.
在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选： 4jis\W}%L3
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 ^5u} 
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 O|%><I?I
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 rN$_(%m_N
菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 8*4X%a=O f
第一节 含微生物样品的采集 Q?7U iTZ
自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。 G+^HZ4jg
一、从土壤中采样 $0D]d.w=
土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 M*8Ef^-U`t
（一）根据土壤特点 8_8 R$ =V
1．土壤有机质含量和通气状况 &'c1"%*%8>
一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 VCNg`6!x
从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。 \@GA;~x.b
2.土壤酸碱度和植被状况 -fT]}T6=
土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。 m:)v>vu
3．地理条件 bh3}[O,L A
南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。 +0;6
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4．季节条件 75jq+O_:
不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。 /3L1Un*
（二）采样方法 z
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用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。 &Op, ?\ 
二．根据微生物生理特点采样 wbyY?tH
1.根据微生物营养类型 %r=uS.+hrF
每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。 X2}\i5{
此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。 \ ExM.T
2.根据微生物的生理特性 w-C ~ Ik
在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。 AE={P*g
三、特殊环境下采样 @{iws@.
1．局部环境条件的影响 jr bEJ.
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。 X/ gIH/
海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L，在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。 u_;*Ay
具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。 |NJe4lw+?
2．极端环境条件的影响 MqGF~h|+
微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。 Z.am^Q^Y!
嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物，在pH2和90℃时生长最好，其代谢类型极不寻常，既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作为厌氧菌用氢还原硫，生成H2S。 l=8)_z;~D
第二节 含微生物样品的富集培养 $#2ik~]>
富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。 v_)a=I%o&2
富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。 ;ZHKTOoK
一、控制培养基的营养成分 )67_yHW
微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。 sDT(3{)L7
现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。 , mEFp_a+
在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的产生。 Y:[WwX|
根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要6～7个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。 W6ZXb_X
二、控制培养条件 OSk:njyC[
在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。 P1;T-.X~&
分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。 ,cPNZ-%
筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件，达到富集的目的。 3p{N7/z(
一般所筛选的微生物通常是好氧菌，但有时也需分离厌氧菌。因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置，还可节省能耗。这时除了配置特殊的培养基外，还需准备特殊的培养装置，创造一个有利于厌氧菌的生长环境，使其数量增加，易于分离。 WJ=DTON

三、抑制不需要的菌类 vA@Kb3 ,
在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。 Kdh(vNB>
从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 9+"D8 J7
筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。 LO]D XW 9
对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。 3{RuR+yi
第三节 微生物的分离 }uo5rB5D
经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 Mm`jk%:%]

❾ （1）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染．某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解

（1）①高压蒸汽灭菌的条件是压力升至102.9kPa（1.05kg/cm²），温度达121～126℃，维持20～30分钟．
②筛选能降解原油的菌株，可以将样品稀释液置于以原油为唯一碳源的固体培养基中培养．
③菌株的接种方法，常用的有两种：平板划线法和稀释涂布平板法．
④菌株分解周围的营养物质，出现分解圈，分解圈大说明该菌株的降解能力强
（2）①在以木糖为唯一碳源的培养基中，只有能分解木糖的酵母菌能生存，可以用来选择能分解木糖的酵母菌．
②利用质粒标记基因表达的标记性状可以判断目的基因是否成功导入受体细胞，故应该选择缺乏尿嘧啶合成能力的酿酒酵母作为受体菌．
③转基因酿酒酵母能利用这葡萄糖和木糖进行发酵且对酒精耐受能力强，故应该接种在以葡萄糖和木糖为碳源的培养基中进行发酵能力测试．随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能利用葡萄糖和木糖产生酒精，且对酒精的耐受能力强．
故答案为：
（1）①121℃；1.05kg/cm² 15
②原油
③平板划线法和稀释涂布平板法
④强
（2）①以木糖为唯一碳源
②尿嘧啶合成
③葡萄糖和木糖 利用葡萄糖和木糖产生酒精，且对酒精耐受能力强