体表微生物检查如何操作

‘壹’ 致病菌感染的微生物学检查基本程序是怎么样的

病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等，该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法，自动化程度高，快速省时、无污染、结果精确，可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1．1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1．2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可同时做细菌鉴定和药敏试验，检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高，常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基，大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1．3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50％ ～80％ ，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染，其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高，ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测，检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌，免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测，肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS．PC

‘贰’ 微生物检测应注意什么事项

1、工作室要矮小平整、光滑、无凹凸不平或棱角、四壁及屋顶用不透水之材质，便于擦洗及杀菌。

2、室内采光面积应大，从室外应能看到室内的情况。

3、为保证无菌室的洁净，无菌室周围需设缓冲走廊，走廊旁再设缓冲间，其面积可小于无菌室。

4、无菌室、缓冲走廊及缓冲间均设有日光灯及紫外灯，杀菌紫外灯离工作台以一米为宜，其电源开关应设在室外。

5、无菌室与缓冲间进出口应设推拉门，门与窗平齐，门缝要封紧，两门要错开，以免空气对流造成污染。

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‘叁’ 简述细菌性疾病微生物学检查的主要程序及方法

能够在得病生物体内提取出病原微生物。病原微生物能够引发其他目美丽病。目美丽病后症状与感染源生物症状相同。在目标体内仍能够提取出相同病原微生物。

标本的采集非常重要。细菌感染通常是通过培养的方法检测的，而病毒通常是通过抗原或者核酸来检测的。细菌培养和鉴定，以及药敏试验，是合理使用抗菌药物的前提，好的标本决定一切，这是检验领域的一句俗话。

不恰当的标本、不恰当的采集时间、不规范的采集方法，可能造成假阴性，假阳性，杂菌污染等，延误诊断，危及生命。对于严重感染，需要确定病原菌的，标本应该选择细菌可能定植的部位，如深部痰液，胸水，血液等，标本提取的时间应该在抗菌药物使用前，最好在发生寒战的时候。

(3)体表微生物检查如何操作扩展阅读：

菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、p H、培养温度和时间等）每克（每毫升）样品生长出来的细菌菌落数量。国内外普遍采用此需氧平板计数法（APC）。国外用于食品、化妆品中微生物计数的螺旋平板计数法（SPC）也需（48±3）h。

这2种方法均为传统的培养方法，操作繁琐，费时费力。近年来，国内外技术人员研究开发了快速测试片技术、生物电化学技术、微菌落技术、发射测量法、微热量技术、ATP 生物发光技术、色谱法等快速检测方法，缩短了检测时间，简化了检测程序。

‘肆’ 微生物计数方法有哪些我想知道详细的操作步骤

微生物的显微直接计数法

一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
五、实验作业：
将实验结果填入下表中：
计数次数 每个大方格菌数 稀 释
倍 数 试管斜面中的总菌数 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次

‘伍’ 院感物表采样后，微生物室怎么操作

物体表面的菌落总数样本，一般是采集在10ml生理盐水管中的。
在微生物室操作时，首先用力振摇试管进行混匀，然后无菌操作取1ml接种于无菌平皿内，倾入灭菌完毕并冷却至45摄氏度左右的营养琼脂，每个稀释度做两块平皿，待琼脂冷却凝固后翻转平板进行培养。

‘陆’ 微生物检验技术考试的基本操作知识有哪些

微生物检验技术操作的最基本的要求就是无菌二字。说起来简单，做起来难，操作过程中稍微不注意，染上了杂菌，实验结果就作废。
无菌操作技术主要包括两方面：
1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
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‘柒’ 洁净区人员体表微生物检查要求

1.保持手、指甲、脸部的清洁卫生。人员卫生极其重要。

2.进入洁净室前必须清洗眼镜并加以消毒。可是眼镜的例行清洗很容易被忘记。

3.精心挑选设计精良的服装系统。洁净生产用服装系统是由不同部分组成的。这样的服装系统必须完整，并以正确的方式穿着，以保证其整体的防护性能。

4.应尽量保持部件与工具洁净。

5.禁止吸烟或使用鼻烟。与不吸烟者相比，吸烟者或使用鼻烟者会向空气中多释放出几百万个粒子。

6.在洁净室内不得梳头，甚至不能碰头发。

7.在洁净室内一般不允许使用化妆品。所有化妆品都有粒子轻轻附着在皮肤上。如果说话、咳嗽、打喷嚏、触摸一件物品(比如触摸面罩)，这些粒子就会从皮肤上掉落下来，而有成为污染物的危险。

8.禁止使用指甲油。指甲油一般比指甲硬，所以过一段时间后，指甲油会出现裂痕。尘埃与微生物就可藏身其中，并到处传播。

9.洁净室内禁使用首饰及手表。因为它们难于清洗，并可能成为感染源或者是污染源。

10.工作只能在洁净的表面上进行。

11.不能把洁净服提来提去，人员不能触摸或翻动洁净服。否则手或者手套污染洁净服的危险会很大。即使搬动洁净服，也会使服装内收信到的粒子散播到周围的环境中。

12.要避免一切不必要的活动。增加身体的活动会增加体表散发的粒子。人员不必要的活动会使周围空气形成涡流。建议以慢动作进行生产活动。

13.洁净室内禁止吃喝，禁止咀嚼口香糖或糖果。

‘捌’ 微生物学的检查方法是有哪些

微生物学检查法

标本

因鼠疫传染性极强，采集标本时必须严格无菌操作。根据病型采取淋巴结穿刺液、肿胀部位组织液、脓汁，血液和痰等。人和动物尸体可取肝、脾、肺、病变淋巴结以及心血等。陈旧尸体取骨髓。将采集标本送至有严密防护措施的专门实验室进行检查，禁止在一般实验室进行操作。

直接涂片镜检

除血液标本外，一般均需涂片或印片，干燥后用甲醇固定，革兰染色或吕氏美兰染色，镜检。在不同材料中，菌体大小、形态有很大差异，除典型形态外，往往可见菌体呈多形态性，需加以注意。

分离培养与鉴定

血液标本需先置肉汤中进行增菌培养。分离培养一般选用血琼脂平板，28摄氏度24小时后，可见较小的露滴状菌落，继续培养则菌落增大至1～2毫米，中央厚而致密，周边逐渐变薄。取可疑菌落进行涂片染色镜检，噬菌体裂解试验，血清凝集试验，特异荧光抗体染色等作出鉴订。

血清学试验

可用于检查鼠疫耶尔森菌抗原或特异性抗体。敏感而特异的试验方法有ELISA、固相放射免疫分析，SPA协同凝集试验等。

检测核酸

用DNA探针杂交方法或PCR技术检测鼠疫耶尔森菌核酸，有助于鼠疫的诊断。PCR敏感性极高，蚤体内有10个鼠疫耶尔森菌感染即可用PCR技术检出。

诊断检查

诊断：取决于病人有接触史及肺部受累表现，病因诊断取决于痰、血或淋巴结吸出物革兰染色、培养，有条件的单位可作直接荧光素标记抗体染色，可提供快速的病因诊断。