如何分离叶片表面微生物

① 微生物的分离与纯化的常用方法有哪些

分离：

稀释倒平皿法

平板划线法

单细胞挑取法

利用选择培养基分离法

纯化：

1、若是你不知道你所要纯化的微生物的特征，最简单的不知道它的菌落特征和形态大小，那现根据你要分离菌的特性，找适合的初筛培养基，找到你要纯化的菌。如纤维素菌，你在培养基中加纤维素粉或CMC-Na作碳源，这样就可以筛选出分解纤维素的菌。然后再用下面的方法继续纯化。

2、若你知道目标菌的形态，可以直接挑混合菌划平板，直到长出当个菌落，并且在镜下没有杂菌即可；或者挑菌稀释涂布得到当个菌落也行。

② 微生物各种分离方法的优缺点

最常用的两种方法：
1．平板划线分离法
把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。
缺点：不能计数，一般用于从菌种的分离纯化。
例如：筛选大肠杆菌菌种。
2．稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数。
例如：测定纯净水中大肠杆菌的含量。

③ 简述如何利用浇注平板法和涂布平板法分离微生物，这两种方法的适用范围分别是什么

两种办法都是先要做好固体培养基的配制，之后灭菌后备用。
1、先将样品按10稀释法进行系列稀释，用的是无菌水即可。根据样品中微生物数目的多少确定用哪三个连续稀释度，一般先10的负6次方到10的负8次方。
2、涂布法，将灭菌的培养基冷却到摄氏50度左右时，倒入无菌的空平板，冷却凝固后备用；将稀释的样品取1毫升放于凝固的固体培养基表面，之后用无菌的玻璃涂棒分布均匀。
3、浇平板法：将1毫升稀释的样品放于空白的无菌培养皿，之后将冷却到45-50度之间的培养基倒入，轻摇混匀、凝固。
4、待完全凝固后倒置培养，即可获得单一菌落。

适用范围：
浇平板法适用于兼性微生物的培养，涂布法适用于好氧微生物的培养。最好是单细胞微生物，或有孢子或芽孢。

④ 微生物纯种分离的方法有哪些

自然界中的微生物总是杂居在一起 即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物 要研究其中某一种微生物 首先必须将它分离出来 下面介绍几种纯种微生物的分离方法
平板划线分离 将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板 用接种环沾取少量待分离的材料 在培养基表面平行或分区划线（图5-5）然后 将培养皿放入恒温箱里培养 在线的开始部分 微生物往往连在一起生长 随着线的延伸 菌数逐渐减少 最后可能形成纯种的单个菌落
液体稀释法 将待分离的样品经过大量稀释后 取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面 培养后就可能得到单个菌落
利用选择培养基进行分离 不同的微生物对不同的试剂 染料 抗生素等具有不同的抵抗能力 利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基 用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的
菌丝尖端切割 这种方法适于丝状真菌 用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端 将它们移到合适的培养基上培养后 就能得到新菌落

⑤ 微生物分离方法

微生物分离法是获得微生物纯培养物的一种分离方法。通过这个方法可实现一种微生物的培养，或获得一个细胞的后代。其具体方法有：

1、稀释倒平皿法。将待分离的材料作一系列稀释，取不同稀释度适量涂布于固体培养基平板上或与已熔化的固体培养基一起倾注入平板内，经过培养即有一个微生物细胞繁殖来的单个菌落。

2、划线法。先将已熔化的固体培养基制成平板，待凝后，取分离材料在上面划线，可作平行划线、扇形划线或其他形状的连续划线，使菌样逐渐减少，最后得到单个孤立的菌落。

(5)如何分离叶片表面微生物扩展阅读：

微生物分离技术的应用措施：

1、减少毒性氧物质的毒害作用：由于常规培养方法使用的高浓度营养基质不利于微生物生长，适当降低营养基质的浓度可以减弱这种不利影响。发现低浓度基质的培养基培养出的细菌在数量和种类上均多于高浓度基质的培养基，但营养浓度过低时会使培养出的微生物数量反而下降。

2、维持微生物间的相互作用：在培养基中加入微生物相互作用的信号分子就可简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求。

3、供应新型的电子供体和受体：不同微生物的代谢过程不同，因此对反应的底物要求也不尽相同。供应微生物需要的特有底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。大量的研究表明，将新颖的电子供体和受体应用到微生物培养中，能够发现未知的生理型微生物。

4、分散微生物细胞：自然界中很多微生物聚集生长，形成“絮体”和“颗粒”等，致使其内部的微生物不易被培养。对“絮体”和“颗粒”进行适度的超声处理，将细胞分散再进行培养，可以使更多的微生物接触培养基而得到培养。

5、延长培养时间：对“寡营养菌”的培养，可适当延长培养时间，使其能长至肉眼可见的尺度。当然培养时间不能无限增长，因为培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高[4]。

6、利用琼脂替代物：琼脂对某些微生物具有毒性作用，采用无害且凝结作用较好的替代物质作为培养基固化剂，可以增加微生物的可培养性。

⑥ 简述如何利用浇注平板法和涂布平板法分离微生物，这两种方法的适用范围分别是什么

浇注平板法和涂布平板法的一开始可能是被涂布物品稀释多少个稀释倍数，然后进行浇注，看菌落，涂布法好像在稀释度上可以进行一个涂布以后这个涂布棒上所带菌体已经量少了，所以再涂布另一个，可能不用太稀释也可以做到。但是很多菌体可能由于对培养基的亲和性比较好，所以在高浓的时候已经脱离涂布棒，可能有些微生物分离不到。（只是个人的观点）

⑦ 自然界分离微生物的一般操作步骤

自然界的微生物，几乎都是混杂在一起的。人们要想观察、研究和利用某一种微生物，就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来。所以微生物的分离是一项十分重要的技术。

一、分离的基本方法

微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。

1.连续稀释分离法

①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。

②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。

③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。

④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。

⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。

2.平板划线分离法

①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。

②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。

③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。

二、各类微生物的分离

1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌

其分离方法见本节“分离的基本方法”

2.从土壤中分离放线菌

①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

3.从土壤中分离霉菌

①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。

②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。

4.从饮水中分离大肠杆菌

①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。

③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。

④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。

⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。

⑧ 微生物分离纯化的原理

1、选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等要求或加入某种抑制造成只剩于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

(8)如何分离叶片表面微生物扩展阅读：

分离技术主要是稀释和选择培养。稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。

最常用的为平板划线法。如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。

⑨ 分离纯化微生物的方法有哪些各方法适用分离什么菌种

主要有：划线法、倒平板法、涂布法，根据分离的菌种选择不同的培养基。

稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离。

分离技术

主要是稀释和选择培养，稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法。

如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。

以上内容参考：网络-微生物分离纯化

⑩ 昆虫肠道微生物 怎样分离叶绿体

叶绿体的分离

【原理】
研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0~4℃温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。
【仪器与用具】
冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0℃下预冷。
【试剂】
①分离介质
含0.33mol/L 山梨醇，50mmol/L Tris-HCl（或Tricine） pH7.6，5mmol/L MgCl2，10mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L 异抗坏血酸钠。
配法：称60g山梨醇、6.06g Tris、1g MgCl2·6H2O、0.6g NaCl、0.77g EDTA-Na2、0.4g异抗坏血酸钠，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至1000ml。
②悬浮和测定介质Ⅰ
0.66mol/L 山梨醇，2mmol/L MgCl2， 2mmol/L MnCl2，4mmol/L EDTA，10mmol/L焦磷酸钠，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。
配法：称60g山梨醇、0.2g MgCl2·6H2O、0.2g MnCl2·4H2O、0.75g EDTANa2、2.23g Na4P2O7·10H2O、6.06g Tris，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至500ml。
③悬浮和测定介质Ⅱ：测定介质Ⅰ稀释1倍。
【方法】
1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0~4℃冰箱或冰瓶中预冷。
2. 分离介质30~50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。
3. 取冷却的菠菜叶片10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。
4. 将滤液装入预冷过的二个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。
5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。
6. 用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（400~600倍）下，观察叶绿体的形态。
上述是机械法从叶片中分离叶绿体，此外也可从原生质体中分离高活性的叶绿体，具体方法可参照《生物生产力和光合作用测定技术》（科学出版社，1986）一书。