生物制品反复冻融试验怎么做

㈠ 为了保持生物样品稳定性多采用什么方法

需要做如下稳定性，每个稳定性试验均包括三个浓度水平（低、中高），每个水平重复5个样本。
1 冻融稳定性
从低至高3种不同浓度的质控样品：LQC、MQC和HQC，经过3次反复冻融（-30℃至25℃）后制备分析。有些公司要求一个冻－融循环必须间隔12hr，即冻12hr后化冻12hr
2。制备后样本稳定性
从低至高3种不同浓度的质控样品：LQC、MQC和HQC，按照试验方法制备5个，将处理后的样品在模拟进样环境中中放置24hr后分析测定。
3。室温放置稳定性（模拟制备样本环境，目的是为了保证制备过程中样本稳定）
从低至高3种不同浓度的质控样品：LQC、MQC和HQC，在室温下（25℃，模拟制备样本环境）放置24hr后，按照试验方法制备分析5个。
4。储备液稳定性（模拟使用标准储备液配制血浆样本的条件，目的是为了保证纯品配制及使用过程中稳定）
配制化合物储备液（标准品溶液），在室温条件下分别于0hr和6hr进样。这个只需要一个浓度水平，重复5个样本
5。长期稳定性（模拟分析样本储存条件长期放置，目的是为了保证分析样本储存过程的稳定性）
将3个浓度的QC样品（LQC, MQC,HQC,n=5）在－30度贮存3个月后，与新鲜配制的标准曲线样品一同进行预处理和测定。从测定结果，可以考察稳定性。
如果你的分析样本能在2周之内分析完毕，只需做2周的长期稳定性即可。

㈡ mtt的实验方法

⒈选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
⒉药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
⒊ 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
⒋培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
⒌MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
⒍理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
⒎实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
⒏避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
调pH 7.4
定容1L 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
⒉、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。
⒊、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物臜（Zā）充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 （储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4，直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）。
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定。如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。
其它的声音
⒈首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。（对于不同的细胞，每孔细胞数要摸索一下，对照组OD在1.4以下为佳，当然通常来说更不要超过2。）
⒉MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
⒊我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系。后来调整浓度，用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的。用40000/M的浓度的组，由于细胞少，药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关系。还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时。
注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。

㈢ 具体方法步骤是什么呢

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

㈣ 生物学实验中病毒怎么保种和接种

1.应该在细胞状态最好的时候,进行病毒接种或复苏;

2.接种前头天,进行细胞传代,细胞数量应以能让细胞在第二天内达到覆盖满90%的培养瓶为准,并且一定要在细胞传代后48h内接种病毒;

3.第二天细胞长为单层且状态较好时,开始接种病毒;

4.先移弃培养瓶中的生长液,用1*PBS轻轻洗细胞面3次,最后用移液管吸干净培养瓶中残留的1*PBS.为保持培养瓶中pH环境的稳定,及减少1*PBS对细胞的刺激作用,可再用生长液轻轻洗细胞面1次,移弃液体,并用移液管吸干净瓶中残留生长液;

5.接种病毒:

①. 一般种毒量按最后所需加入维持液体积的10%,15%或20%来计算,一般10%即可,若希望病变速度快一些,可以加大种毒量,如15%或20%;

②. 如果用小塑料瓶种毒,一般该培养瓶加8-9ml培养液,加入0.8ml病毒即可,病毒加入后,盖上瓶塞,轻轻将摇晃瓶子,让病毒液在细胞面上来回10几次;

③. 在对照细胞中,加入相同的0.8ml维持液;

6.将种毒瓶和对照瓶一起放入37oC,CO2烘箱培养1h,其中每隔15min,需要将种毒瓶和对照瓶拿出,轻轻摇晃瓶子,保证病毒液或维持液能在细胞面上来回20-30次,使病毒液或维持液能充分接触细胞;

7.1h后,在晃动瓶子4次后,重新进入无菌间,在培养瓶中加入维持液;

①. 维持液配方一:

MEM 2鸖 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%);

②. 维持液配方二:

MEM 3%谷氨酰胺 1%双抗 NaHCO3(其用量以调节pH至7.0为准,浓度为6%);

③. 一般还是使用有FBS的维持液,因为对细胞有一定的保护作用;

8.将加完维持液的培养瓶放回37oC,CO2烘箱培养,每天观察,如果有条件,可以每天拍照,直到有90%的细胞出现CPE后,可以进行收毒;

9.收毒可以用反复冻融方法:即将细胞培养瓶放入-20oC冰箱,冻起来后,直接拿出来等起融化后,使劲摇晃瓶子,让细胞破裂释放出病毒颗粒,这样反复4次,即可达到收毒目的;

10.收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管,在1,000-2,000转下离心10mins,以此除去细胞碎片,将离心后的上清夜转移,弃底部沉淀,该上清液即可用于病毒浓缩醇化,或病毒滴度测定,或中和试验等。

㈤ 设计实验从牛奶中分离蛋白质

从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，
胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。
二、实验材料和试剂
脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。
三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml，
用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。
2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。
①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。

另外附上：
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品

㈥ 冻融试验的试验内容

美国FDA1998年6月发表的稳定性指导原则草案对此问题提出了一个解决的办法，即对于易发生物相分离、黏度减小、沉淀或聚集的药品需通过热循环实验来验证其运输或使用过程中的稳定性。作为影响因素实验的一部分，应模拟药品在运输与使用过程中可能碰到的温度条件下循环考察上市包装的药品的稳定性。具体方法如下：
1）对于温度变化范围在冰点以上的药品，热循环实验应包括三次循环，每次循环应在2~8℃两天，然后在40℃加速条件下考察两天。
2）对于可能暴露于冰点以下的药品，热循环实验应包括三次循环，每次循环应在-10~-20℃两天，然后在40℃加速条件下考察两天。
3）对于吸入气雾剂，推荐的热循环实验包括一天内进行三到四次六小时的循环，温度在冰点以下和40℃（75~85%RH）之间，该实验需持续考察六周。
4）对于冷冻保存的药品，应考察该药在微波炉或热水浴中加速融化时的稳定性，除非说明书中明确禁止如此操作。
如经过验证，也可采用其他的方法进行考察。