1. 你认为所有的微生物细胞都可以利用血球计数板进行计数吗为什么
不能，稍微小点的细菌用血球板计数就不准。
血球计数板在显微镜下直接进行测定。它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体或孢子进行计数。
2. 细菌计数的含义是什么
细菌计数 counting of bacteria
指测计酵母、细菌等的细胞数.有总菌计数和活菌计数两种计数法.后者是测计试样中的活细菌数.二者都是先把试样稀释成适于测计的浓度,再用种种方法进行细胞数的测计.一般认为用细胞计数器测计更为精确.有的方法是把细胞用血球容量计进行离心沉淀,从其刻度的容积进行换算；还有一种方法是比浊法.在测计固氮细菌时,可用凯氏定氮法测定有机氮（或是蛋白态氮）,然后换算成细菌数.进行活菌计数时,先把样品稀释,然后将一定量稀释样品混入依菌性质制成的溶融状态的琼脂培养基中进行平面培养,再根据菌落数进行统计.对已鉴别过的菌种或具有某种特定性质的细菌来说,活菌计数比较简单,但对土壤微生物区系量的分析就比较复杂了.
3. 血细胞计数板计数原理
一、目的要求
1．了解血细胞计数板的构造和使用方法。
2．学会用血细胞计数板对酵母细胞进行计数。
二、基本原理
利用血细胞计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1或0.4mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。适用于稀释的菌悬液（或孢子悬液），即液体培养基中菌体的计数。
优点：直观、快速。
血细胞计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。
计数时，常采用样方法。
每一个大方格边长为1或2mm，则每一大方格的面积为1或4mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1或0.4mm3。
在计数时，通常数四或五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格0.1mm3有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，
同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则
三、器材
酿酒酵母菌悬液，血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。
四、操作步骤
1．稀释
将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
2．镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
显微镜计数
静止5分钟后，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选4或5个中格中的菌体进行计数。
镜检计数方法：①方格内细胞的计数顺序为左上→右上→右下→左下。②压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数。③酵母细胞若有粘连， 要数出团块中的每一个细胞。④出芽酵母的芽体体积若超过细胞体积的1/2，则算独立个体。⑤计数总数不少于300个细胞。
5．清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
4. 为什么可以用菌落进行细菌计数和纯培养
在大多数情况下，菌落是由单个微生物细胞固体培养基表面或内部生长繁殖，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。就是说，一个菌落，就是由一个细菌或其他微生物细胞生长繁殖形成的。
在一定范围的固体培养基上用一定量的菌悬液进行涂布培养，形成多少个菌落，就说明原来用的一定量或体积的菌悬液中，就含有多少个微生物细胞个体。这就是用菌落生长的个数来进行细菌计数的原理。
至于纯培养，也是一样的。纯培养是指只在单一种类存在的状态下所进行的生物培养。一个菌落是由一个细菌细胞生长形成的，细菌生长繁殖具有遗传稳定性，这个菌落中所有的子细胞都是由一个细菌细胞形成的，当然它们就具有相同的遗传基因，具有同样的生理生化特征，属于同种细菌。这就是纯培养。
5. 测定培养液中微生物的菌体数，为什么在显微镜下要用血细胞计数板直接计数
光电比浊计数法
一、目的要求
1．了解光电比浊计数法的原理。
2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。
光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。
（三）器材
1．菌种 酿酒酵母培养液
2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。
（四）操作步骤
1．标准曲线制作
（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。
（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。
（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表
每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定
(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。
3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。
（五）实验报告
l．结果
每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数
6. 微生物的计数
有专业地电子计数仪器
也有实验法
微生物的显微直接计数法
一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
可以再参考单细胞微生物显微计数法
7. 什么是微生物计数
1] 病毒以外的微生物的计数。样品中可测到总的(死的和活的)细胞数，称为总细胞数,样品中可测到的活的细胞数称活细胞数。
8. 微生物计数方法有哪些
测定微生物计数的方法有很多,主要有以下几种：
1.血细胞计数法
将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上,在显微镜下计算4~5个中格的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再以此为依据,估算总菌数.
①此法的缺点是不能区分死菌和活菌.
②对压在小方格界线上的细菌,应当取平均值计数.
③此法可用于测定培养液中酵母菌种群数量的变化
2.稀释涂布平板法
原理：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落.培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌.
①这一方法常用来统计样品中活菌的数目
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,原因是当两个活多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落.因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定.但不适于测定样品中丝状体微生物,例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等.
④此法若不培养成菌落,可通过将一定量的菌液均匀地涂布在玻片上的一定面积上,经固定染色后在显微镜下计数,这样又称涂片计数法.染色可用台盼蓝,台盼蓝能使死细胞染成蓝色,可分别计数死细胞和活细胞.
3.滤膜法
滤膜法是当样品中菌数很低时,可将一定体积的湖水、海水或饮用水灯样品通过膜过滤器.然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上（或一定面积上）的细菌数.
此法也可以通过培养观察形成的菌落数来推算样品中的菌数.例如测定饮用水中大肠杆菌的数目：将已知体积的水过滤后,将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养.在该培养基上大肠杆菌的菌落呈现黑色,可根据培养基上黑色菌落的数目,计算出水样中大肠杆菌的数目.
此法也是统计样品中活菌的数目.
4.比浊法
原理是在一定范围内,菌是悬液中细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大.因此可借助与分光光度计,在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度表示菌量.实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内,否则不准确.
5.显微镜直接计数法
在课本生物选修1生物技术实践P22中“除了上述活菌计数法外,显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法.”这里说的显微镜直接计数,我认为应该是在稀释涂布的基础上不培养成菌落而通过染色的方法在显微镜下直接计数.再如滤膜法也一样,可以有两种情况.
另外,微生物计数法发展迅速,多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法可以用来统计微生物的数目.
9. 食品微生物检测中出现一些半透明的菌落也要计数吗为什么会出现这样的情况，正常吗
微生物导致食品腐败变质、微生物毒素(致病菌、寄生虫)及传染病流行(肝炎病毒)引起的食源性疾病是我国食品安全的头号问题。在我国的食品卫生管理中，微生物指标分为菌落总数(细菌总数)、大肠菌群、霉菌、酵母菌与致病菌。它们造成食源性疾病，可表现为轻度不适应慢性疾病甚至有生命危险。致病菌是食品安全的杀手，在我国的食品卫生标准中规定为“不得检出”。 菌落总数的测定是食品卫生检验的一个重要指标。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 菌落主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌对食品被污染程序的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。
10. 平板菌落计数的原理是什么它适用于哪些微生物的计数
原理：
将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
适用于：
通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。