生物素怎么标记探针

㈠ 基因探针的探针标记

探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广，也容易获得，但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是，将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中，经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤，才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂，有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下，由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基，所以有良好的信号放大作用，但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基，渗透性强，但信号放大作用则较差，合成的多相寡核苷酸探针，敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记。特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期短，虽使用不方便，但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶，经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物（ABC法），酶催化底物显色，观察结果。ABC法底物显色生成不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差，成本高，但便于运输、保存，灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同时在3´端修复加入被标记核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀，多用于大分子DNA标记，(>1000bp最好)，但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，因此它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段（KlenowFragment）催化下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应体系中含有a-32P-dNTP时，即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法（又叫尾标）。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测，该探针可用核酸合成仪人工合成，克隆出的探针一般较长，特异性好，标记量大，杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。
8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，
17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固红，30秒—5min；
19、双蒸水浸洗，5minX3次
20、脱水、透明、封片

㈡ 如何用光敏生物素标记质粒

如何用光敏生物素标记质粒
常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。
切口平移法（nick translation）是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下：
⑴取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液 (0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白），加入除标记物（如?-32 p-dATP）外的其它三种dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）溶液，20mmol/L溶液各1?l。
⑵加入100?ci（10?l）标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l，混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l（约5单位）E.coli DNA polymerase I，混匀。

㈢ 生物素是什么意思及作用

一、生物素的定义：生物素又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。

生物素是20世纪30年代在研究酵母生长因子和根瘤菌的生长与呼吸促进因子时，从肝中发现的一种可以防治由于喂食生鸡蛋蛋白诱导的大鼠脱毛和皮肤损伤的因子。

二、生物素的用途：生物素，即人们所熟知的维生素H，它能使身体将食物转化为自身能量。生物素有利于细胞的健康和再生。糖尿病患者可以通过生物素改善血糖的调节。头发和指甲的健康也需要生物素。

（1）保健用途

糖尿病。补充生物素，生物素通过改善胰岛素和血糖的使用帮助改善血糖的调节。头发和指甲。补充生物素可以修复薄弱爆裂的脚趾甲和手指甲，改善头发的健康。生物素也可以修复那些由于生物素水平偏低引起过早的灰白头发。

（2）美容用途

生物素具有出色的美容作用，可保持皮肤嫩白、指甲光滑等。这个发现也为生物素产品开拓了一大新药业用途。美容化妆品行业是国际大产业之一，美容化妆品的国际市场总销售额远远高于药品的销售额，生物素在美肤、美甲（指甲）及美发上的新应用必将导致药用级生物素销量的上升。

（3）科研用途

生物素可以用作核酸探针的标记物，它能与核酸分子的UTP或dUTP 5‘位上的C相结合，并可与亲和素结合而被检测。在检测的过程中，生物素只用作固定连接，而不用作信号检测。

(3)生物素怎么标记探针扩展阅读：

生物素的食物来源：

（1）在牛奶、牛肝、蛋黄、动物肾脏、草莓、柚子、葡萄等水果、瘦肉、糙米、啤酒、小麦中都含有生物素。在复合维生素B和多种维生素的制剂中，通常都含有维生素H。

（2）富含该维生素的美食：芥末双脆、 蟹肉西兰花、芥茉菠菜、鱼香腰花、油焖鳝鱼、素炒三丝、蛋黄南瓜、芒果柳橙苹果汁、胡萝卜炖羊肉、松花淡菜粥、清炖萝卜牛肉、银杞明目汤、鸡肝胡萝卜粥、牛肉蔬

（3）菜浓汤、芒果葡萄柚汁、芒果柳橙苹果汁、木瓜生姜汁、芦荟柠檬汁、甜橙柠檬汁、杏猕猴桃汁。

㈣ 核酸探针的标记

常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。
切口平移法（nick translation）是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下：
⑴取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液 (0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白），加入除标记物（如?-32 p-dATP）外的其它三种dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）溶液，20mmol/L溶液各1?l。
⑵加入100?ci（10?l）标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l，混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l（约5单位）E.coli DNA polymerase I，混匀。
⑶置14-16℃反应1-2小时。 可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素（photobiotin），光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链DNA及RNA的标记，探针可在-20℃下保存8-10个月以上。具体操作方法如下：
⑴将双链DNA变性或用NaOH处理形成缺口，单链DNA或RNA毋需处理，将核酸样品溶于水。
⑵暗室下在微量离心管中加入10?g DNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混匀。
⑶冰浴中打开离心管盖，在300-500瓦灯下照射10分钟（液面距灯泡10cm）。
⑷加入100?l 0.1mol/L Tris－HCl，pH8.0，加入100?l 2-丁醇抽提两次，离心，弃上层。
⑸乙醇沉淀核酸探针；用70%乙醇漂洗真空抽干，备用。
除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过PCR反应直接完成。

㈤ 生物素标记的DNA探针用什么方法检测

生物素标记的DNA探针用什么方法检测
以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板,人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段,可用来快速检测病原体.
怎么检测：
将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针.可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合,经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在.
以细菌为例,目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向.加之分子杂交技术的高敏感性,分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景.细菌的基因组大小约5×106bp,约含3000个基因.（各种细菌之间绝大部分DNA是相同的,要获得某细菌特异的核酸探针,通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法,即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库.然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选,产生杂交信号的克隆被剔除,最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段.将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定,亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能.）括号里比较重要!

㈥ dna探针技术的原理

DNA探针利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的精确性，单链DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性；用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。

㈦ 基因探针是什么

基因探针（probe）又称“寡核苷酸探针”，简称“探针”，就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。

2．探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。

为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。

寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。

3.探针的标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。

㈧ 生物名词解释 探针

是DNA探针么?
高中生物第3册中有啊
DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性；用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。