如何分离微生物细胞

⑴ 微生物的分离平板涂布法和平板划线法分离微生物的区别

微生物的分离平板涂布法和平板划线法分离微生物的区别
由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 、 1 ∶ 10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 稀释涂布法：
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。
一般用于平板培养基的回收率计数！！

⑵ 如何从复杂的土壤样本中分离我们所需要的目标微生物

如何从复杂的土壤样本中分离我们所需要的目标微生物？
有机肥之中有机质的分解转化是一个复杂的过程，微生物活动在分解转化过程之中起着重要作用。土壤环境非常适合微生物活动，所以土壤之中天然微生物数量最多。因为土壤之中微生物种类繁多，数量大；一克土壤之中，微生物有几十种到几百种，几亿到几十亿个，土壤微生物繁殖迅速，在有机质的转化和分解之中起着重要作用。土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌和藻类。

（1）细菌



细菌是一种单细胞微生物，是土壤之中分布最广、数量最多的微生物。细菌有三种基本形态：球形、杆状和螺旋形；有球菌、杆菌和螺旋体（40种）；包括号菌&41；三种类型。土壤细菌按其营养类型可分为自养菌、兼性自养菌和异养菌。

（2） 真菌



土壤真菌分布广泛，适应广泛的酸性条件，在PH4.0条件之下生长良好，对森林土壤有机质的转化起着重要作用。土壤真菌是异养的。它们必须从土壤有机质之中获取能量和碳源，并在发育过程之中需要良好的供氧。根据真菌与树木的关系及其营养类型，真菌可分为腐生真菌、寄生真菌和共生真菌。

（3） 放线菌



放线菌是细长的菌丝体，呈分枝状或放射状。它们在土壤之中仅次于细菌。大多数是腐生植物。许多放线菌能分解纤维素、淀粉、脂肪、木质素和蛋白质。

⑶ 微生物获得纯培养的方法理论依据是什么

微生物纯培养的方法
一、固体培养基分离
1、稀释倒平板
特点：菌落分离较为均匀，进行微生物计数结果相对准确。但操作相对麻烦，热敏感菌有时易被烫死，而严格好氧菌也可能因被固定在培养基中生长受到影响。
2、涂布平板法
特点：操作相对简单，是较常使用的常规方法。但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确的结果。
3、平板划线法
特点：操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离。
应用：这三种方法可用于所有能在固体培养基表面形成菌落的微生物的纯培养分离。并且，通过选用适当的选择平板及培养条件，可直接分离各种具有特定生理特征的微生物。和厌氧罐或厌氧手套箱技术结合，这3种方法也可用于获得各种厌氧菌的纯培养。
4、稀释摇管法
特点：稀释倒平板法的一种变通形式，但由于菌落形成在琼脂柱的中间，观察和挑取都相对困难。
应用：在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察。
二、液体培养基分离
1、稀释法
特点：工作量大，是否获得纯培养需依靠统计学的推测。
应用：不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计。
2、富集培养
特点：一般不能直接获得微生物的纯培养，在通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，需再通过平板法进行相应微生物纯培养的分离和检测。 应用：
（1）根据某种微生物的特殊生长要求，按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效分离；
（2）分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
三、显微操作
单细胞（孢子）挑取
特点：分离过程直观，可靠，但对仪器和操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究。而挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物。 应用：从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子，获得其纯培养。

⑷ 分离纯化微生物的方法有哪些各方法适用分离什么菌种

主要有：划线法、倒平板法、涂布法，根据分离的菌种选择不同的培养基。

稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离。

分离技术

主要是稀释和选择培养，稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法。

如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。

以上内容参考：网络-微生物分离纯化

⑸ 我想知道细胞破碎的方法及各种方法的原理和优缺点

机械法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。
1. 组织捣碎机
将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。
2. 匀浆器
先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。
3. 研钵
多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。
4. 细菌磨
是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。

物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有：
1. 反复冻溶法
原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。
2. 急热骤冷法
将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。
3. 超声波处理
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。
特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。
存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。

化学及生物化学法：
1. 自溶法
在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。
2. 酶溶法
利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。
特点：
a) 此法适用多种微生物；
b) 具有作用条件温和；
c) 内含物成分不易受到破坏；
d) 细胞壁损坏的程度可以控制。
存在的问题：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来困难。
3. 化学渗透法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。
特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。
存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
小结
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

⑹ 如何分离培养生长速度缓慢的微生物

富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长

⑺ 请问：怎样分离提纯微生物

1. 稀释涂布平板法
(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；
(2) 制备土壤稀释溶液 称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；
(3) 涂布 将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基；
(4) 培养 将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板;马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day；
(5) 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，大菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2.平板划线分离法
(1)倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期；
(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落；
(3) 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

⑻ 如何从微生物细胞中分离和纯化色素

可以用萃取分离呀。或者用有机溶剂，把色素分离出来。

⑼ 如何从自然界中分离纯化自己想要的目的微生物

这个过程叫做“筛选”。
首先确定你所要筛选的目的微生物，并设计好“筛子”。以纤维素酶产生菌的筛选为例。
先找可能存在此类微生物的环境，如森林里的枯枝烂叶和腐质土。采好样品，拿回实验室，首先进行扩大培养。就是把样品中所有的微生物都培养增殖。一般就用全营养培养基。
培养液稀释不同倍数后，做平板单细胞培养，这时就要用到“筛子”了。对于纤维素酶产生菌，筛子可选用可溶性纤维素。平板培养时，用可溶性纤维素作唯一碳源，不产生纤维素酶的微生物就不能生长（或生长极弱），把生长良好的微生物挑选出来，再进行扩大培养，再用纤维素唯一碳源的培养基进行筛选，并挑选生长优势菌落，重复以上步骤（可以多挑选几支进行对比选择）。几次以后，用纤维素粉（不溶性的）做唯一碳源的培养基，进行平板培养，纤维素酶产生量越大、活性越高，产生的透明圈直径就越大。用这种办法可能对酶产生量大、活性高的菌种做进一步筛选。
其它目的微生物的筛选步骤也差不多。
关键是采样地点的选择和“筛子”的设计。
希望对你有用。

⑽ 如何分离土壤中的产纤维素酶的微生物

土样破碎，无菌水冲悬，低速离心取上清，梯度稀释，平板涂布，挑单菌落液体培养，并在平板上画线培养（菌落较单一的话可以省略），在画方格的纤维素平板上挑单菌落培养，挑水解圈的菌落液体培养，利用滤纸条鉴定水解能力，做生长曲线，优化培养条件。要做鉴定的话就是看菌落形态，理化性质，16s测序做进化树……自然界中蕴藏着巨大的微生物资源，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。土壤和海水这两大类资源宝库的开发具有重要意义。我们可以从土壤、腐木筛选相应的产酶微生物，从污水中筛选各种能够产生分解糖类、脂类、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香物质有机磷农药、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物。在极端环境可筛选嗜热微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、耐高压微生物等，并开发极端微生物酶品种。进21世纪以来，各国已在生物产业研究中投入了巨大的财力和科研力量。随着能源、资源和环境问题的日趋严重，生物资源利用已被全球广泛重视，成为世界各国的战略性研究重点。在自然界中，纤维素类物质是最廉价、最丰富的一类可再生资源，是人类社会赖以生存的基本物质来源。全世界植物体生成量每年高达1 500亿t干物质，其中有50%以上为纤维素和半纤维素。采用生物酶催化技术可将农作物、树木和其他植物及其残体、畜禽粪便、有机废弃物等生物质转化为工业原料，达到合理、可循环利用自然生物资源的目的。担子菌亚门Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycets)和子囊菌亚门(Ascomycotina)的部分真菌都具有很强的产生纤维素酶和漆酶的能力，备受生化工业领域的关注。其中，白腐菌、褐腐菌和软腐菌是自然界中降解木材的主要真菌。在过去的30多年里，有关白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有关软腐菌的研究则集中在纤维素降解酶系方面；而有关褐腐菌的研究主要集中在降解木质纤维素机制方面。