⑴ 实验室微生物检验需要注意哪些问题
微生物检验无菌操作的注意事项有很多细节,日常的微生物检验过程中要注意无菌操作,除了要在洁净台和操作器皿上的消毒,还需要注意人员卫生和环境的卫生。
【操作技巧】
进行培养时,动作要准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便,工作台面上的用品要有合理的布局,原则上应是右手使用的东西放置在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性,组织或细胞在未做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在未用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方,瓶口最易污染,加液时如吸管尖碰到瓶口,则应将吸管丢掉。
【培养前准备】
在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内,然后开始消毒。这可以避免开始实验后.囚物品不全往返拿取而增加污染机会。
【火焰消毒】
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时,首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作,如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等,都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意:金属器械不能在为焰中烧的时间过长,以防退火,烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长,以免烧焦产生有毒气体,危害培养细胞。
【洗手和着装】
原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时,可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时,因整个前臂要伸入箱内,应着长袖的清洁工作服,并于开始操作前要用75%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
【操作台消毒】
体外培养细胞缺乏抗感染能力,所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意,技术操作不规范,也会导致污染。因而.为在一切操作中为最大可能的保证无菌.每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min,超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线,消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置.否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
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⑵ 在微生物实验室中无菌操作需要什么仪器
培养皿 培养基 枪头 移液枪 ep管 涂布器 酒精灯 等
⑶ 病原微生物实验室建设需购置哪些设备
大件仪器:培养箱,超净工作台,高压灭菌锅,冰箱,摇床,干燥箱 集菌仪 水浴锅等相关的
附带的有:培养基,培养皿,移液枪,枪头,移液管,试管,锥形瓶, 剪刀,镊子,酒精灯,酒精棉,棉签,无菌口罩手套,牛皮纸等,其它想不起来了
⑷ 致病菌感染的微生物学检查基本程序是怎么样的
病原微生物种类繁多,变异迅速,快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前,应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等,该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物,又称病原体,有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病,也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强,往往造成世界性大流行,因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐,检测周期长,而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展,病原学诊断已不再局限于病原体水平,深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法,自动化程度高,快速省时、无污染、结果精确,可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主,将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1.1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小,大多无色半透明状,将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速,对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用,例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备,在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1.2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间,检测周期较长,不能同时处理批量样本。为解决这一问题,各种自动化培养和鉴定系统不断产生,传统鉴定方法也在逐步改进,大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪,可同时做细菌鉴定和药敏试验,检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高,常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基,大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌,生长指数明显高于血平板。1.3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体,包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的,将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养,再将病原体接种于相应的组织细胞中后,病原体可在其中繁殖增长,引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内,引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术,简化了鉴定步骤,常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性,不仅可检测样本中病原体抗原,也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50% ~80% ,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染,其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高,ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起,如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上,通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物,在外部磁场磁力的作用下,将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠,如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等,广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测,检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌,免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g~;IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测,肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS.PC
⑸ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些
1、快速测试片技术法
快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。
细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代,其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。
2、生物电化学方法
生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷,从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中,培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化,所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。
常见的有:阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。
3、微菌落技术
微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点,其研究始于 20 世纪50年代,定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始,国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。
4、气相色谱法
气相色谱应用到微生物的检测中,主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异,利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等,以确定病原微生物的特异性化学标志成分,协助病原诊断和检测。
5、高效液相色谱法
利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等,以确定病原微生物的特异性化学标志成分,协助病原诊断和检测。
⑹ 培养细菌注意哪些事项
(一) 病料采集和运送对动物进行病原菌检疫,病料的采集和运送是否得当,是关系到能否分离到病原菌的关键。首先充分了解各种病原菌(目的菌)在被检动物体内及其分泌物和排泄物中的分布情况,不同的病原菌在患病动物体内分布情况不同,即使是同一种病原菌,在病的不同时期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断。采取病料所用器械和宣传品器都应事先消毒,确保无毒,采样时应无菌操作。如果动物已死亡,取样应注意以下几点:⑴ 对急性死亡的动物,从耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色镜检,在排除炭疽后方能剖检取样;⑵ 采取病料时间,原则是越早越好,夏季要在动物死亡后2小时内采取病料;⑶ 为了提高病原微生物的阳性分离率,采取的病料要尽量可能齐全,除了内脏、淋巴结和局部病变组织外,还应采取脑组织和骨髓,以防遗漏;⑷ 认真填写好病料送检单和剖检病理变化记录。下面介绍病料的采取方法。
1. 脓汁先将表面流水线,然后以灭菌注射器或吸管抽取深部的浓汁;若是开口化脓灶或皮肤、粘膜表面化脓,可用灭菌棉拭子浸沾脓汁后,放入试管中。
2. 内脏器官采取心、肺、肝、脾、肾等有病变的组织及其淋巴结,无病变时也要采取,无菌剪取1-2cm大的方块,分别装入灭菌容器内。
3. 血液要全血时,无菌采取血液10m,立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%柠檬酸钠液1ml的灭菌试管内,并立即混合均匀。要分离血清时,将无菌采取的血液直接注入灭菌试管,待血液自然凝固后分离血清。从尸体采取血液时,可用灭菌注射器或吸管从右心房抽取。
4. 皮肤和粘膜采取病变局部的皮肤和粘膜及其所属淋巴结,放入甘油盐水溶液中。
5. 脑和脊髓无菌采取脑的脊髓约1-2cm大的方块,放入甘油盐水溶液中。
6. 胆汁用灭菌注射器抽出后放入灭菌试管中。
7. 肠和胃剪取有病变的部位一段或一块。也可将肠管一段(约6-8cm)用线扎紧两端后剪下送往实验室。
8. 粪便可用棉拭子插入肛门沾取,或扑杀病畜后由肠管采取,立即放低温条件下保存。
9. 乳汁先用消毒yao液洗净乳头及其附近,弃去最初挤出的几滴乳汁,然后采取乳汁约10ml放入灭菌试管内。
10. 流产胎儿可将整个胎儿用塑料薄膜包紧,装入箱中送检。
11. 小动物、禽和鱼等可按上述流产胎儿方式整体送检。在距离实验室很近,又有隔离运输条件时,也可将发病小动物直接送检。
(二) 病料的处理采集的病料,在接种培养前,应对其性状进行观察,例如:是否脓性带血或腐败,有何异味,并作记录。各种病料在分离培养前均应制备一张涂片,作革兰氏染色、镜检,以了解细菌的形态、染色特性,并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果,对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。
如果病料是病变组织,又是用无菌方法采集的,在接种前一般无需作特别处理。但如果病料被杂菌污染严重,则需根据要分离的病原菌的特性,采用一些对病原菌无害,但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法,以抑制杂菌生长。例如从粪便中分离沙门氏杆菌,可将粪合接种于亚xi酸钠肉汤中,作增菌处理。在这种培养基中,其它杂菌被抑制,而沙门氏杆菌则能自由繁殖。又如,分离布鲁氏杆菌、胎儿弯曲杆菌、炭疽杆菌、副结核杆菌可用选择性抗菌琼脂。分离链球菌和猪丹毒杆菌用叠氮钠结晶紫血琼脂等。如果从肠道内容物或从污染有不产生芽胞的杂菌培养物中分离能形成芽胞的细菌(如魏氏梭菌、破伤风梭菌等),可将病料在80℃加热15分钟,以杀死不形成芽胞的杂菌,取此材料再接种培养基,即容易获得纯培养物。有些病料(如奶、尿等)含菌太少,则应先作集菌处理,然后接种,以提高检出率,其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物;过滤后取沉积于滤板上表面的病料作培养。还有些细菌往往在细胞浆内集结成团,在它们所形成的病灶中含菌较少,遇到这种情况,可将病料组织磨碎,制成乳剂,加入酶、酸或碱,消化组织,使菌团散开,然后离心,收集沉淀物作培养(如从肠粘膜分离副结核杆菌即用此法)。
⑺ 如何处理微生物实验室的废弃物
废液的处理
食品微生物实验室废水来自有致病菌的培养物、洗涤水以及其他诊断检测样品等。对于实验室产生的废水,应尽快消毒灭菌,严防污染扩散,要加强污染源管理。
废液处理方法有化学药剂法和热力消毒灭菌法。根据不同的处理对象和处理要求采用不同的方法对废液进行处理。
(一)化学药剂法
化学消毒药剂按其杀菌由强到弱可分为灭菌剂、消毒剂、抑菌剂。废水化学法消毒最好采用相关发生器、虹吸投药法或高位槽投药法,也可以在废水入口处直接投加。投放液氯用加氯机,投放二氧化氯用二氧化氯发生器,投放次氯酸钠用发生器或液体药剂,投放臭氧用臭氧发生器,投放过氧化氢用过氧化氢发生器。
(二)物理热力法
生物安全实验室物理热力法废液处理系统是通过加热方式连续对废液进行消毒灭菌处理的,目的是使废液在尽可能短的时间内得到处理,避免引起污染扩散。
连续式废液消毒灭菌是一种对生物性废液进行灭菌的新技术,主要运用于生物安全实验室废液的处理。实验室产生的废液通过双层排水管道从废液入口进入缓冲储液罐,产生的废气经过高效过滤器除菌后从透气管排出。当液面达到一定的高度时,废液出口阀门自动打开,同时启动流速控制泵。将废液以设定流速压入预加热/冷却柜进行预加热处理,之后进入电加热灭菌器,在灭菌器内废液通过电加热灭菌盘管进行高温灭菌。已灭菌的废液再进入预加热/冷却柜经缓冲管后进行冷却,冷却后的废液通过排污口排出。如需如此处理,则通过回流管回流至储液罐,或直接进行再次连续处理。预加热/冷却柜通过热交换器,使已灭菌的高温废液对进入的待处理废液进行预加热,同时自己得到冷却,以节约能源。与传统的储罐式灭菌技术相比,连续废液消毒在效率、有效性、安全性和节约成本等方面都有了很大提高。
(三)混合处理法
对于生物安全实验室来说,其实验的对象种类较多,需要对废液进行不同的处理,适用于采用化学药剂和物理热力混合法处理系统。该系统将热力法连续废液灭菌系统与化学药剂处理装置结合,对废液进行热力灭菌处理和化学药剂处理,还可对灭菌系统内管道进行化学消毒。
(四)第二级废水处理系统
第二级废水处理系统可以处理经生物安全实验室内第一级废液处理系统处理后排出的废水,还可以处理来自食堂、洗澡池、卫生间、洗手盆的一般生活污水及普通实验过程中排放的无致病性微生物,但含有其他化学污染物的废水。第二级废水处理系统具备有效去除酸碱、重金属、有机溶剂及杀灭一般微生物的功能,使处理后的水质达到排放或中水回用的标准。
第二级废水处理系统的原理及工艺流程如下:来自生物安全实验室的废水经隔油器除油,同生活污水经由孔径为10mm的格栅除去较大的固体漂浮物后,汇集到调节池进行混合处理,再经直径2mm~5mm的格栅处理,除去直径大于5mm的固体漂浮物,进入初沉池。沉淀后上清液流入生化处理池进行生化处理,再经二次沉淀池沉淀后进入接触池进行最后处理,符合GB 国家标准后排放。
02 废气的处理
食品微生物实验室的排风、仪器设备(生物安全柜、通风柜等)的排气会带有致病微生物,这种废气如果直接排放到实验室外,将会感染人群及动物,引起流行病暴发,严重威胁人类生命健康。因此,实验室产生的废气,经过严格消毒处理后方可排放。
食品微生物实验室的污染废气主要来自实验室空调通风系统、生物安全柜、负压通风柜、干/湿热消毒灭菌器、离心机排风罩等易产生带菌、带毒气溶胶的设备的排风,以及焚烧炉排放的烟尘等。
对安装的送排风系统的实验室总体要求是控制实验室的气流方向和压力梯度,使通过初效、中效、高效三级过滤器后的气体由清洁区流向污染区;室内采用上送下排,使污染区和半污染区的气流死角和涡流降至最小程度;特别要指出的是,要确保实验室空气只能通过高效过滤器经专用排风管道排出。第一级高效过滤器应安装在实验室排风管道的前端(其他通风设备同理).若需加装第二级排风高效过滤器,应将其串接在离第一道高效过滤器后500 mm以远至排风机之前的地方(选择易维护、易操作和易更换的地方,如排风机技术夹层)。高效空气过滤器的安装与更换应牢固、符合气密性要求,并应由有资质的技术人员来进行。通常高效过滤器在更换前应经过消毒灭菌,或采用可在气密袋中进行过滤器更换的位置。坐应急处理时维修人员应身着防护服,更换下来的高效过滤器应立即进行消毒或焚烧。每个高效过滤器在安装、更换、维护后都应进行检测,运行期间要进行日常监视,并根据实际情况定期进行检测,以确保其性能。应能控制实验室排风系统与其他排风设备(生物安全柜、负压通风柜、动物负压隔离器、离心机排风罩等)排风的压力平衡和响应速度匹配。应安装自动联锁装置,确保实验室内不出现正压和确保其他排风设备气流不倒流。实验室的排风应经高效过滤后由排风机向空中排放。外部排风口应远离送风口,并设置在主导风的下风向,应至少高于所在建筑屋面2m以上,应有防雨、防鼠、防虫设计,但不影响气体直接向上空排放。在送风和排风总管处应安装气密性密封阀,必要时可完全关闭以进行室内或风管化学熏蒸或循环消毒灭菌。
03 固体废弃物的处理
固体废弃物是指人类在生产、建设、日常生活和其他活动中产生的,且对所有者在一定时间和地点已不再具有使用价值而被废弃的固态或半固态物质。
《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》(中华人民共和国主席令第三十一号, 2004年12月29日)中规定了工业固体废物和生活垃圾污染环境的防治,并对危险废物污染环境的防治做出了特别规定。
食品微生物实验室的固体废弃物来源于实验器材废物、含有传染性生物因子的废弃样本和培养物、废弃的感染动物、实验室废弃的空气净化材料等。食品微生物实验室产生的废弃物属危险废物,不能回收利用,必须经灭菌处理后丢弃或焚烧处置后填埋。固体废物由于不适当地处理、储存、运输、处置或管理上的疏忽,会对人体健康或环境造成显着的威胁。应按照《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》的规定进行污染废物的收集、运输、储存。
所有弃置的样本、培养物和其他生物性材料应弃置于专门设计的、专用的并有标记的用于处置危险废弃物的容器内,并集中存放在指定地点。在从实验室取走之前,应通过高压灭菌、化学消毒或其他被认可的技术进行处理,然后置于密封的容器中,分类做上标记,由专人安全运出实验室。生物废弃物容器的充满量,不能超过其设计容量。利器(包括针头、小刀、金属和玻璃等)应直接弃置于耐扎容器内。培养物必须经121 ℃ 30 min高压灭菌。
载玻片上的活菌标本应装于密闭容器中进行高压灭菌,或经3%来苏尔溶液或5%石炭酸溶液浸泡24 h后方可丢弃。染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24 h (消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121 ℃ 30 min高压灭菌。涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,致病菌的冲洗液须冲在烧杯中,经高压灭菌后方可倒入下水道。做凝集试验用的玻片或平皿,必须高压灭菌后才能洗涤。打碎的培养物,立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位,浸泡30 min后再擦拭干净。污染的工作服或进行致病菌检测所穿的工作服、非一次性的实验帽和口罩等,应放入专用消毒袋内,经高压灭菌后方能洗涤。
实验室应确保由经过适当培训的人员,使用适当的个人防护装备和设备处理危险废弃物。不允许积存垃圾和积存实验室废弃物,已装满的容器应及时封存,在去污染或最终处置之前,应存放在指定的通常在实验室区内的安全地方。答案来自
⑻ 临床医学怎么消除微生物的影响
消除微生物的影响?临床医学上,消除微生物的影响,方法有很多。比如消毒,比如无菌操作,比如使用抗生素。具体要看什么场合。比如对物品,就可以进行消毒。对具体的操作,可以采取无菌操作的方式。方法很多很多,要结合具体情况选择合适的措施。