如何提高微生物原生质体融合率

‘壹’ 微生物原生质体融合的主要步骤

用PEG或仙台病毒就可以了.

‘贰’ 微生物通过原生质体融合技术的处理后会怎样

微生物的细胞融合，需要先将细胞壁溶解后，由原生质体进行融合。在微生物中，通过原生质体融合技术的处理可以培育出新的菌种。一些具有亲代双重有用特性的优良菌株已经培育成功，如生产药用的链霉素新菌种，发酵和糖化性能齐备的酵母新菌种等。

‘叁’ 用原生质体融合法进行微生物育种有何优点

可以增加基因组结构的多样性，比单体繁殖更有适应性。

‘肆’ 简述原生质体融合技术微生物育种有哪些新思路

基因组重排技术(genome shuffling)技术的概念,基因组重排技术是经典微生物诱变育种技术与原生质体融合技术的有机结合。
首先对微生物菌体进行诱变,筛选出正向突变菌株,然后通过原生质体󰀂递推式融合 使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合,筛选出符合育种要求的融合子,从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株

‘伍’ 想做微生物的原生质体融合，革兰氏阴性，求相关的高IF英文文献，THX

阴性是好的

‘陆’ 微生物原生质体融合技术的的路线

当两个细胞的细胞膜密切接触，在一定条件下促使细胞膜发生变化，导致细胞互相合并，这就是细胞融合，又称体细胞杂交。这样产生的杂种细胞兼有两个亲本的遗传物质，通过组织培养就能产生杂种个体或杂种细胞群。自然界的受精作用事实上就是雌雄生殖细胞的细胞融合的实例。

原生质融合法，即利用电压穿孔或温和化学溶解处理，让欲改造的细胞及携带有外源基因的细胞表面，产生一些暂时性的孔疏现象，然后再让它们紧密地依偎在一起，相互交换遗传物质，便达到改造目的。

‘柒’ 原生质体融合的高pH—高钙法是怎样做的

高pH—高钙法是受动物细胞融合研究的启发而产生的。用pH9.510.5、大于0.03molL浓度的Casuperscript2+superscript溶液处理原生质体，融合效果较好。高pH能导致质膜表面离子特性的改变，增加了质膜的流动性，有利于原生质体的融合。钙能稳定原生质体，也起联系融合的作用。

具体处理方法是：在原生质体沉淀中加入含有0.05molL：CaClsubscript2subscript·2Hsubscript2subscriptO和0.4molL甘露醇，pH调整到10.5，在37摄氏度下保温0.5h，可使原生质体融合率达到10%左右。

‘捌’ 原生质体融合的步骤

原生质体融合的程序包括：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备和再生（过程见8.1.1）；③原生质体的融合；④融合子遗传标记的筛选；⑤融合子的鉴定。

8.2.2.1 标记菌株的筛选

进行原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于融合后重组子的筛选。常用营养缺陷型和抗性作为遗传标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态作为遗传标记。遗传标记的选择要根据实际实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷型或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷型标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生质体的融合

原生质体融合就是把亲株的原生质体在高渗条件下进行混合。在原生质体融合中，诱导融合的方法主要有化学法（PEG促融法）、物理法（包括电融合和激光诱导融合法等）。

仅仅将原生质体等量地混合在一起融合频率通常是很低的，只有通过加入融合剂例如表面活性剂聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如电击和激光诱导等，融合频率才会提高。

（1）PEG促融法：其诱导融合的可能机制是PEG带有负电荷的醚键，与带负电荷的原生质体相遇后，在Ca²⁺等阳离子作用下形成共同的静电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。在有钙离子存在的条件下融合时为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为pH值能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常采用30%～40%。由于PEG的加入，原生质体间的黏着强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合时间不宜过长。

（2）电融合法：其原理是在短时间强电场的作用下，当原生质体被置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体，使原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串，原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了PEG融合的随机过程。该法的优点是融合频率高，无化学毒性，操作简便，可在显微镜下进行，具有极强的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光照射接触处，从而使质膜击穿或产生微米级的微孔，质膜上产生微孔是一个可逆的过程，质膜恢复的过程中细胞连接微孔的表面曲率很高，使细胞处于高张力状态，此时细胞由哑铃形逐渐变为圆球状，进而细胞发生融合。该法的优点是毒性小，损伤小，具高度选择性；缺点是操作技术难度大，所需设备昂贵复杂，因此很难被推广应用。

8.2.2.3 融合子遗传标记的筛选

原生质体融合后，融合子的选择方法是使原生质体融合技术得以应用的关键。以A和B细胞融合来说，可能会形成AA，AB及BB 三种融合形式。而要筛选出的是AB，即具有A细胞核B细胞的两个遗传标记就可以确定其为融合子。因此，就可以通过A和B细胞所分别具有的选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者则是不稳定的，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态转接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。融合子的筛选是融合过程的关键。下面列举几种常见的筛选方法。营养缺陷型标记筛选融合子、抗药性标记筛选融合子、荧光色素标记筛选融合子、灭活原生质体标记筛选融合子、利用双亲对碳源利用不同而筛选融合子和利用某些特殊生理特征作为标记筛选融合子等方法筛选。

8.2.2.4 融合子的鉴定

融合子筛选出后，还要对其进行鉴定。常用的鉴定方法有菌体或孢子形态、大小的比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，DNA含量的比较，对结构蛋白及非基因直接编码的次生代谢产物的分析，对染色体稳定性的研究等。刘玲等（2007）采用酯酶同工酶电泳对f1和f2融合子进行鉴定，融合子有不同于亲本的新酶带出现，融合子菌落呈现新的性状，菌落形态、颜色、菌丝形状都与亲本部分性状相似，又存在差异，并且菌株生长速度也不同于双亲本，在生理生化性状上与亲本存在明显的差异，这说明融合子f1、f2是融合双亲性状的新菌株。

‘玖’ 细菌原生质融合的资料！急求！

一、目的要求
了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。

二、基本原理
原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一) 原生质体融合的优点
(1) 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2) 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二) 原生质体融合步骤
(1) 选择亲本 选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2) 制备原生质体 经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3) 促融合 聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4) 原生质体再生 原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5) 检出融合子 利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6) 融合子筛选 产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
(三) 原生质体再生率和融合率计算

三、实验材料
(一) 菌种
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二) 培养基(见附录)
(1) 完全培养基(CM，液体)；
(2) 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；
(3) 基本培养基(MM)；
(4) 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；
(5) 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。
(6) 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。
(三) 缓冲液
(1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融合剂
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六) 溶菌酶液
酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。
(七)器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器