生物破胶剂酶有哪些应用

A. 所有生物酶的作用

按照酶促反应的性质，酶可分为六大类：

EC1，氧化还原酶类(Oxidorectases)：催化底物进行氧化还原反应的酶类。例如，乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。
EC2，转移酶类(Transferases)：催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类。例如，甲基转移酶、氨基转移酶、己糖激酶、磷酸化酶等。
EC3，水解酶类(Hydrolases)：催化底物发生水解反应的酶类。例如，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。
EC4，裂解酶类(Lyases)：催化从底物中移去一个基团并留下双键的反应或其逆反应的酶类。例如，碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合酶等。
EC5，异构酶类(Isomerase)：催化各种同分异构体之间的相互转化的酶类。例如，磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。
EC6，连接酶类(Ligases)：催化两分子底物合成为一分子化合物，同时偶联有ATP的磷酸键断裂释放能量的酶类。例如，谷氨酰胺合成酶、氨基酸:tRNA连接酶等。

以下为列表：

EC1：氧化还原酶

催化底物进行氧化还原反应的酶类。例如，乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。

EC1.1：作用在给体的CH-OH上
EC1.1.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.1.1.1：醇脱氢酶
EC1.2：作用在给体的醛基或氧桥上
EC1.2.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.2.1.1：已删除，以EC1.1.1.284和EC4.4.1.22 代替
EC1.3：作用在给体的CH-CH上
EC1.3.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.3.1.1：二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD+)
EC1.4：作用在给体的CH-NH2上
EC1.4.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.4.1.1：丙氨酸脱氢酶
EC1.5：作用在给体的CH-NH上
EC1.5.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.5.1.1：吡咯啉-2-羧酸还原酶
EC1.6：作用在NADH或NADPH上
EC1.6.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.6.1.1：NAD(P)+转氢酶(B)
EC1.6.1.2：NAD(P)+转氢酶(AB)
EC1.7：以其他含氮化合物为给体
EC1.7.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.7.1.1：硝酸还原酶(NADH+)
EC1.8：作用在给体的硫族上
EC1.8.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.8.1.1：半胱胺脱氢酶
已删除
EC1.9：作用在给体的血红素上
EC1.9.3：以氧为受体
EC1.9.3.1：细胞色素C氧化酶
EC1.10：以联苯酚及其相关化合物为给体
EC1.10.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.10.1.1：顺-苊-1,2-二醇脱氢酶
EC1.11：以过氧化物为给体
EC1.11.1：过氧化物酶类
EC1.11.1.1：NADH过氧化物酶§NADH peroxidase
EC1.12：以氢为给体
EC1.12.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.12.1.1：氢化酶
已转移至EC1.18.99.1
EC1.13：加氧酶
EC1.13.11：加双氧酶
EC1.13.11.1：儿茶酚-1,2-加双氧酶
EC1.14：
EC1.14.11：
EC1.14.11.1：γ-丁基甜菜碱加双氧酶
EC1.15：以超氧化物为给体
EC1.15.1：
EC1.15.1.1：超氧化物歧化酶
EC1.15.1.2：超氧化物还原酶
EC1.16：氧化金属离子
EC1.16.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.16.1.1：汞(II)还原酶
EC1.17：作用在给体的CH-CH2上
EC1.17.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.17.1.1：CDP-4-氢-6-脱氧葡萄糖还原酶
EC1.18：以铁-硫蛋白为给体
EC1.18.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.18.1.1：红氧还蛋白—NAD+还原酶
EC1.19：以黄素氧还蛋白为给体
EC1.19.6：以氮分子为受体
EC1.19.6.1：固氮酶(黄素氧还蛋白)
EC1.20：作用于给体的磷或砷上
EC1.20.1：以NAD+或NADP+为受体
EC1.20.1.1：膦酸脱氢酶
EC1.21：作用在X-H和Y-H上形成X-Y
EC1.21.3：以氧为受体
EC1.21.3.1：异青霉素-N合酶
EC1.97：其他氧化还原酶
EC1.97.1：
EC1.97.1.1：氯酸还原酶

EC2：转移酶
催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类。例如，甲基转移酶、氨基转移酶、己糖激酶、磷酸化酶等。

EC2.1：转移一个碳
EC2.1.1：甲基转移酶
EC2.1.1.1：烟酰胺-N-甲基转移酶
EC2.1.1.2：胍乙酸-N-甲基转移酶
EC2.1.1.3：噻亭—高半胱氨酸-S-甲基转移酶
EC2.1.1.4：乙酰血清素-O-甲基转移酶
EC2.1.1.5：甜菜碱—高半胱氨酸-S-甲基转移酶
EC2.1.1.6：邻苯二酚-O-甲基转移酶
EC2.1.1.7：烟酸-N-甲基转移酶
EC2.1.1.8：组胺-N-甲基转移酶
EC2.1.1.9：硫醇-S-甲基转移酶
EC2.1.1.10：高半胱氨酸-S-甲基转移酶
EC2.1.1.11：镁原卟啉IX甲基转移酶
EC2.1.1.12：甲硫氨酸-S-甲基转移酶
EC2.1.1.13：甲硫氨酸合酶
EC2.1.1.14：5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸—高半胱氨酸-S-甲基转移酶
EC2.1.1.15：脂肪酸-O-甲基转移酶
EC2.1.1.16：亚甲基-脂肪酰基磷脂合酶
EC2.1.1.17：磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶
EC2.1.1.18：多糖-O-甲基转移酶
EC2.1.1.19：三甲基锍—四氢叶酸-N-甲基转移酶
EC2.1.1.20：甘氨酸-N-甲基转移酶
EC2.2：转移醛基或酮基
EC2.3：酰基转移酶
EC2.4：糖基转移酶
EC2.5：转移除了甲基的烷基和芳基
EC2.6：转移含氮基团
EC2.7：转移含磷基团
EC2.8：转移含硫基团
EC2.9：转移含硒基团

EC3：水解酶
催化底物发生水解反应的酶类。例如，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。

EC3.1：作用在酯键上
EC3.1.1：羧酸酯水解酶
EC3.1.1.1：羧酸酯酶
EC3.1.1.2：芳基酯酶
EC3.1.1.3：三酰甘油脂肪酶
EC3.1.1.4：磷脂酶A2
EC3.1.1.5：溶血磷脂酶
EC3.1.1.6：乙酰酯酶
EC3.1.1.7：乙酰胆碱酯酶
EC3.1.1.8：胆碱酯酶
EC3.1.1.9：苯甲酰胆碱酯酶
已删除。为EC3.1.1.8的副反应
EC3.1.1.10：托品碱酯酶
EC3.1.1.11：果胶酯酶
EC3.1.1.12：维A酯酶
已删除。与EC3.1.1.1相同
EC3.1.1.13：固醇脂酶
EC3.1.1.14：叶绿素酶
EC3.1.1.15：L-阿拉伯糖酸内酯酶
EC3.1.1.16：4-羧甲基-4-羟基异丁烯酸内酯酶
已删除。EC5.3.3.4与EC3.1.1.24的混合物
EC3.1.1.17：葡糖酸内酯酶
EC3.1.1.18：醛糖酸内酯酶
已删除。属于EC3.1.1.17
EC3.1.1.19：糖醛酸内酯酶
EC3.1.1.20：鞣酸酶
EC3.1.1.21：棕榈酸视黄酯酶
EC3.1.1.22：二聚羟基丁酸水解酶
EC3.1.1.23：酰基甘油脂肪酶
EC3.1.1.24：3-氧己二酸烯醇内酯酶
EC3.1.1.25：1,4-内酯酶
EC3.1.1.26：半乳糖酯酶
EC3.1.1.27：吡哆醇内酯酶
EC3.1.1.28：酰基肉毒碱水解酶
EC3.1.1.29：氨酰基-tRNA水解酶
EC3.1.1.30：D-阿拉伯糖酸内酯酶
EC3.2：糖基化酶
EC3.3：作用在醚键上
EC3.4：肽酶
EC3.5：作用在除了肽键的C-N键上
EC3.6：作用于酸酐上
EC3.7：作用在C-C键上
EC3.8：作用在卤键上
EC3.9：作用在P-N键上
EC3.10：作用在S-N键上
EC3.11：作用在C-P键上
EC3.12：作用在S-S键上
EC3.13：作用在C-S键上

EC4：裂合酶
催化从底物中移去一个基团并留下双键的反应或其逆反应的酶类。例如，碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合酶等。

EC4.1：碳-碳裂合酶
EC4.1.1：羧基裂合酶
EC4.1.1.1：丙酮酸脱羧酶
EC4.1.1.2：草酸脱羧酶
EC4.1.1.3：草酰乙酸脱羧酶
EC4.1.1.4：乙酰乙酸脱羧酶
EC4.1.1.5：乙酰乳酸脱羧酶
EC4.1.1.6：乌头酸脱羧酶
EC4.1.1.7：苯甲酰甲酸脱羧酶
EC4.1.1.8：草酰CoA脱羧酶
EC4.1.1.9：丙二酰CoA脱羧酶
EC4.1.1.10：氨基丙二酸脱羧酶
已删除。属于EC4.1.1.12
EC4.1.1.11：天冬氨酸-1-脱羧酶
EC4.1.1.12：天冬氨酸-4-脱羧酶
EC4.1.1.13：氨甲酰基天冬氨酸脱羧酶
已删除。
EC4.1.1.14：缬氨酸脱羧酶
EC4.1.1.15：谷氨酸脱羧酶
EC4.1.1.16：羟谷氨酸脱羧酶
EC4.1.1.17：鸟氨酸脱羧酶
EC4.1.1.18：赖氨酸脱羧酶
EC4.1.1.19：精氨酸脱羧酶
EC4.1.1.20：二氨基庚二酸脱羧酶
EC4.1.1.21：磷酸核糖基氨基咪唑脱羧酶
EC4.1.1.22：组氨酸脱羧酶
EC4.1.1.23：乳清苷-5'-脱羧酶
EC4.1.1.24：氨基苯酸脱羧酶
EC4.1.1.25：酪氨酸脱羧酶
EC4.1.1.26：多巴脱羧酶
已删除。属于EC4.1.1.28
EC4.1.1.27：色氨酸脱羧酶
已删除。属于EC4.1.1.28
EC4.1.1.28：L-芳香氨基酸脱羧酶
EC4.1.1.29：硫代丙氨酸脱羧酶
EC4.1.1.30：泛酰半胱氨酸脱羧酶
EC4.1.1.31：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶
EC4.1.1.32：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)
EC4.1.1.33：二磷酸甲羟戊酸脱羧酶
EC4.1.1.34：氢-L-古洛糖酸脱羧酶
EC4.1.1.35：UDP-葡糖醛酸脱羧酶
EC4.1.1.36：磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶
EC4.1.1.37：尿卟啉原脱羧酶
EC4.1.1.38：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(二磷酸)
EC4.1.1.39：核酮糖-二磷酸脱羧酶
EC4.1.1.40：羟基丙酮酸脱羧酶
EC4.2：碳-氧裂合酶
EC4.3：碳-氮裂合酶
EC4.4：碳-硫裂合酶
EC4.5：碳-卤裂合酶
EC4.6：磷-氧裂合酶
EC4.99：其他裂合酶

EC5：异构酶
催化各种同分异构体之间的相互转化的酶类。例如，磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。

EC5.1：消旋酶和差向异构酶
EC5.1.1：作用于氨基酸及其衍生物上
EC5.1.1.1：丙氨酸消旋酶
EC5.1.1.2：甲硫氨酸消旋酶
EC5.1.1.3：谷氨酸消旋酶
EC5.1.1.4：脯氨酸消旋酶
EC5.1.1.5：赖氨酸消旋酶
EC5.1.1.6：苏氨酸消旋酶
EC5.1.1.7：二氨基庚二酸差向异构酶
EC5.1.1.8：4-羟脯氨酸差向异构酶
EC5.1.1.9：精氨酸消旋酶
EC5.1.1.10：氨基酸消旋酶
EC5.1.1.11：苯丙氨酸消旋酶(ATP水解)
EC5.1.1.12：鸟氨酸消旋酶
EC5.1.1.13：天冬氨酸消旋酶
EC5.1.1.14：诺卡菌素-A 差向异构酶
EC5.1.1.15：2-氨6-己内酰胺消旋酶
EC5.1.1.16：蛋白质-丝氨酸差向异构酶
EC5.1.1.17：异青霉素-N 差向异构酶
EC5.2：顺反异构酶
EC5.3：分子内异构酶
EC5.4：变位酶
EC5.5：分子内裂合酶
EC5.6：其他异构酶

EC6：连接酶

催化两分子底物合成为一分子化合物，同时偶联有ATP的磷酸键断裂释放能量的酶类。例如，谷氨酰胺合成酶、氨基酸:tRNA连接酶等。

EC6.1：形成C-O键
EC6.1.1：
EC6.1.1：酪氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.2：色氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.3：苏氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.4：亮氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.5：异亮氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.6：赖氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.7：丙氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.8：D-丙氨酸-sRNA合成酶
EC6.1.9：—tRNA连接酶
已删除
EC6.1.10：缬氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.11：甲硫氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.12：丝氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.13：D-丙氨酸—聚(磷酸核糖醇)连接酶
EC6.1.14：甘氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.15：脯氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.16：半胱氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.17：谷氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.18：谷氨酰胺—tRNA连接酶
EC6.1.19：精氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.20：苯丙氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.21：组氨酸—tRNA连接酶
EC6.1.22：天冬酰胺—tRNA连接酶
EC6.1.23：天冬氨酸—tRNAAsn连接酶
EC6.1.24：谷氨酸—tRNAGln连接酶
EC6.1.25：赖氨酸—tRNAPyl连接酶
EC6.2：形成C-S键
EC6.3：形成C-N键
EC6.4：形成C-C键
EC6.5：形成磷酸酯键
EC6.6：形成N-M键

B. 生物破胶酶的发酵生产及其破胶性能研究

郑承纲 李宗田 张汝生

（中国石化石油勘探开发研究院，北京 100081）

摘 要 针对中低温油藏压裂破胶施工的需求，筛选出生物破胶酶生产菌株——地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BG1，通过两水平试验设计确定了该菌株产酶培养基中的显着因素（碳源、有机氮源和无机氮源），在此基础上，又通过中心法则试验设计对该菌株的产酶培养基组成做进一步优化，最终确定了发酵培养基组成为4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。采用该优化培养基，BG1菌株的生物破胶酶产量达239 U/L。该菌株所产生物破胶酶拥有良好的稳定性，在低于50℃中温浴6h，酶活力保持率可达85％以上，同时该酶对非极端pH条件、常规地层离子和化学助剂亦表现出良好的稳定性。通过对该酶破胶性能进行研究，发现该酶在中、低温环境下破胶效果好，30 ～60℃温度下破胶后的压裂液黏度分别为11.1cp、2.23cP、1.97cP和4.65cP，破胶返排后地层伤害小，模拟实验伤害率仅为11.37％，体现了该生物破胶酶在中、低温油藏压裂施工中的良好应用前景。

关键词 地衣芽孢杆菌 生物破胶酶 中低温油藏 稳定性 破胶效能

Proction of Enzymatic Gel Breaker and Its

Gel Breaking Potential Evaluation

ZHENG Chenggang，LI Zongtian，ZHANG Rusheng

（Exploration and Proction Research Institute，SINOPEC，Beijing 100081，China）

Abstract In order to fill the fracturing gel breaking demand in those moderate－/low－temperature reservoirs， Bacillus licheniformis BG1 was selected for the proction of enzymatic gel breaker（EGB）.The significant variables in the EGB fermentation medium were identified as carbon source，organic nitrogen and inorganic nitrogen source by two－level factorial design and were further optimized through full－factorial central composite design.The optimal composition of EGB fermentation medium was 4.08 g/L carbon source，11.74 g/L organic nitrogen，5.22 g/L inorganic nitrogen，2 g/L phosphorus source，1.0 g/L sulfur source，0.05 g/L trace elements and the maximum EGB proction yield was 239U/L.The EGB proced by B.licheniformis BG1 exhibited good thermostability that after incubation at a temperature below 50 ℃for 6 h，the resial activity was still above 85％ retention rate.The enzymatic breaker also showed a good stability withthe non－extreme pH conditions，conventional ion formation and chemical additives.The viscosities of broken fracturing fluids were 11.1 cP，2.23 cP，1.97 cP and 4.65 cP at a temperature ranging from 30℃ to 60℃，respectively.EGB operation caused little damage to the formation that the damage rate was merely 11.37％ in the physical simulation experiment.Based on the results from this work，the enzymatic gel breaker presents a good prospect in the hydraulic fracturing.

Key words Bacillus licheniformis；enzymatic gel breaker；moderate－/low－temperature reservoirs； stability；gel breaking efficiency

水力压裂是油气井增产、注水井增注的一项重要技术措施，全国压裂措施工艺每年达上万井次，年增油近千万吨。其过程是用压裂泵组将压裂液以高压力压开地层，形成裂缝；并用支撑剂支撑裂缝，增加导流能力、减小流动阻力，是一种增产、增注措施。压裂液的性能是影响压裂施工成败的关键因素，压裂液的破胶效果直接影响压裂液的反排和增产效果，破胶失败或者不理想会造成严重的地层伤害。根据低渗透储层的特点，利用核磁共振技术及岩心流动试验进行了压裂液伤害机理研究，结果表明：压裂液黏滞力和大分子基团滞留是造成伤害的主要因素。因而提高破胶效果，降低压裂液的黏滞阻力，是解决压裂液伤害的一个重要办法^［1，2］。

大多数水基压裂液所使用的稠化剂为（变性）胍豆胶，压裂作业中常用化学（氧化型）破胶剂为过硫酸钾、过硫酸铵等，其优点是价格低、使用方便、破胶迅速、破胶液黏度在10mPa·s以下。但在实际应用中，氧化破胶剂存在着一些缺陷，包括：(1)反应时间及其活性主要依赖于温度，温度低于50℃时，反应很慢，必须添加低温催化剂，而高于93℃时降解反应发生很快，反应不易控制，反应迅速，使压裂液提前降解而失去输送支撑剂的能力，甚至导致压裂施工失败；(2)它属于非特殊性反应物，能和遇到的任何反应物如管材、地层基质和烃类等发生反应，易生成与地层不配伍的污染物，造成地层伤害；(3)作用时间短，氧化型破胶剂往往在到达目的裂缝前消耗殆尽，达不到有效破胶的目的；(4)反应不彻底，造成胍豆胶不能完全降解，约20％的分子量大于2.0×10⁶的聚合物基本上未降解，并产生大量残渣。而生物破胶酶是具有高催化能力和很好活性的生物蛋白，它在催化反应时自身的形态和结构不发生改变，其反应特异性决定了其专一性分解多糖聚合物结构中特定的糖苷键，并将其降解为单糖和二糖，这些特异性的生物破胶酶主要有Beta－1，4甘露聚糖酶、Beta－甘露糖苷酶和Alpha－半乳糖苷酶等。研究表明，化学破胶剂破胶后的聚合物分子量为（1.0～3.0）×10⁵Da，而生物酶破胶方法后的胶液分子量仅为2000～4000Da，其破胶性能大大高于氧化型破胶剂，压裂后无残渣，返排效果好^［3］。同时，生物破胶酶主要应用于30～60℃的油藏，有效弥补化学破胶剂在中、低温油藏应用中的瓶颈问题（如反应缓慢、需要添加催化剂、破胶难以控制）^［4～6］。本文对新型压裂液生物破胶酶进行了研究，优化了其发酵生产条件，并对其破胶性能进行了相关分析。

1 生物破胶酶的发酵生产和纯化

1.1 菌种、培养基和发酵条件

本研究中所用生物破胶酶生产菌株为本实验所保存菌种BG1，分离自某油田原油污染土样，经16SrDNA序列分析和生理生化反应鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株保存于－80℃冰箱甘油管（20％，v/v）中，使用前经固体培养基进行活化后作为接种物。

种子液培养采用LB培养基，其组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH＝7.0～7.2；经响应面法优化后的发酵培养基组成为：4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。接种浓度为2.0％，接种后的培养物置于37℃摇床中在转速180rpm条件下培养48h。

1.2 酶活力的测定

本研究中破胶酶的酶活力检测采用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法），分别以0mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL浓度的还原糖溶液作为反应物制作标准曲线。将发酵结束后的菌液于4℃下转速为8000rpm离心10min，去除菌体，取上清液作为粗酶液，以0.6％浓度胍豆胶溶液作为底物进行水解反应，反应条件为50℃温浴中反应10min，检测反应物中还原糖的浓度。1个酶活力单位（U）定义为：在50℃温浴条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量^［7］。

1.3 破胶酶发酵生产的优化

为了获得高产量的生物破胶酶，在菌株最佳培养的基础上，对发酵培养基组成进行优化。首先将破胶酶发酵生产中的碳源、有机氮源、无机氮源、磷源、硫源和微量元素，作为培养基优化实验中的6个试验因素（X₁—X₆），通过两水平试验设计（Two－level factorial design）筛选其中的显着因素，进而对显着因素的浓度进行进一步优化。本实验中，因素的两水平包括正效应（＋）和负效应（－），正效应的因素均取高值，负效应的因素均取低值，通过使因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，从而确定逼近最大响应区域的水平值，并把对响应值影响较大的因素（F＜0.05，置信度95％）作为显着因素^［8］。

两水平试验设计及其响应值如表1所示，通过对实验结果进行分析发现，对破胶酶的生产有显着影响的因素为碳源（99.90％）、有机氮源（99.51％）和无机氮源（95.11％），而磷源（10.52％）、硫源（32.27％）和微量元素（33.11％）对发酵液酶产量影响较小。6个试验因素中，碳源、有机氮源、无机氮源和磷源对破胶酶的发酵生产均呈现负效应，而硫源和微量元素对破胶酶的合成呈现正效应。将碳源、有机氮源和无机氮源3个显着因素分别作为自变量（A、B和C），采用中心法则试验设计（central composite design）对影响破胶酶发酵生产的底物浓度水平进行优化。中心法则试验设计共包括20组实验，其中交互试验23组、中心点6组和边际点6组，每一自变量的5个试验水平分别以－1.68、－1 、0、＋1和＋1.68进行编码^［9］，如表2所示。

表1 两水平试验设计及其响应值（n＝6）

续表

表2 中心法则试验设计及其响应值

通过拟合得到一个描述响应值与自变量关系的多元回归模型，如公式（1）所示。模型的P－value值为0.0041，该值远远小于0.05，表明回归方程的F检验显着，所获得的模型能够准确地反映破胶酶的发酵生产情况。

油气成藏理论与勘探开发技术（五）

由响应面回归分析和回归方程拟合绘制酶产量与碳源、有机氮源和无机氮源的响应面，如图1所示。

图1 碳源、有机氮源和无机氮源对破胶酶产量影响的响应面

通过该模型计算出响应值（酶产量）对因素A、B、C存在极值点，对Y进行极值分析，确定3个因子最优试验点（A、B、C）的代码值（0.57、0.25、0.41），即碳源浓度为4.08g/L，有机氮源和无机氮源浓度分别为11.74g/L和5.22g/L时，该模型预测的破胶酶产量存在极大值，通过实验验证实际酶产量为239U/mL。

1.4 破胶酶的分离、纯化和保存

破胶酶发酵结束后，将发酵液在转速5000～10000rpm情况下离心30min去除菌体，并用0.22μm滤除去残余菌体和不溶物质，将获得的粗酶液经琼脂糖层析柱（20mm×250mm）洗脱：层析柱以pH＝7.3的Tris－HCl缓冲液平衡后以0.5～1.5mol的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速率为5～15mL/h，收集酶液并用饱和硫酸铵溶液沉淀，将获得的破胶酶由缓冲液稀释至200～400U/mL后低温保存^［10］。用于压裂液破胶酶保存的缓冲液组成为：0.1M的pH＝7.2的磷酸缓冲液，杀菌剂50×10^－6，甘油50％。

2 生物破胶酶稳定性研究

由于生物破胶酶使用过程中要面临油藏复杂的物理化学条件，同时其破胶活性还会受到压裂液体系中其他助剂的影响，因此，本研究中考察了各种物理化学因素（温度、pH、地层离子和化学助剂等）对生物破胶酶活力的影响。

2.1 温度和pH因素对酶活力保持率的影响

首先，研究温度和pH因素对生物酶活力保持情况的影响，酶活力保持率如图2所示，实验结果表明：生物破胶酶在中低温条件下有良好的热稳定性，在低于50℃的环境中温浴6h后，其酶活力保持率能达到85％以上，而超过50℃后，酶活力保持率随温度升高开始下降，70℃时，温浴后的酶活力仅为初始值的35％；生物破胶酶在非极端pH环境中（pH ＝5.0～9.0）能较好地维持其活性，而超出这一pH值范围后，酶活力保持率会迅速下降。

图2 温度和pH因素对酶活力保持率的影响

2.2 地层离子和化学助剂对酶活力保持率的影响

本文还对地层离子和化学助剂对生物酶活力保持情况的影响进行了研究，如表3所示。实验结果表明：地层水中的主要无机离子对破胶酶活力无明显影响；而压裂体系中的常规助剂对酶活力的保持有一定影响，本实验中，生物破胶酶在含有EDTA、杀菌剂和交联剂的溶液中温浴6h后，酶活力的保持率分别为81％、76％和94％。现场的压裂液体系非常复杂，因此，在实际应用中，有必要对各种助剂组分对生物酶活性的影响进行预实验。

表3 地层离子和化学助剂对酶活力保持率的影响

3 生物破胶酶的破胶性能研究

3.1 生物酶破胶降黏性能研究

针对中、低温储层的特点，本实验中所使用的压裂液配方为0.35％羟丙基胍胶、6％交联剂（1.0％硼砂溶液）、1.0％黏土稳定剂、0.5％杀菌剂，pH ＝8.5，生物破胶酶的添加浓度为20U/L。本文研究了不同温度下（20～80℃）的破胶效果，压裂液的降黏效果如图3所示，在40℃和50℃下反应10h后，破胶后的胶液黏度仅为2.23cP和1.97cP，而在30℃和60℃时，破胶后的胶液黏度分别为11.1cP和4.65cP。在破胶反应30min时，压裂液尚保持较高的黏度，维持了较好的携砂能力。可见，本研究中的生物破胶酶，完全可以满足中、低温油藏压裂施工的作业要求。

3.2 物理模拟破胶岩心伤害实验

当压裂液返排时，由于破胶不彻底往往留下很多残渣（固体不溶物），降低裂缝的导流能力。在室内应用物理模拟实验，制作人工胶结岩心模型（10cm×2.5cm）模拟水力压裂伤害过程，50℃恒温箱中，驱替人工配制的模拟地层水并计算模型的原始渗透率；将模型饱和含有20U/L破胶酶的压裂液液，关闭驱替系统，并在恒温箱中进行破胶反应12h；反应结束后，以模拟地层水进行反向驱替，计算返排后的模型渗透率（驱替至压力恒定），并以未添加破胶酶（APS破胶）的实验组作为对照模拟地层伤害实验，并计算伤害率^［11］。

图3 不同温度下破胶酶的破胶效果

表4 地层伤害实验

从表4的结果不难看出，相比空白对照，生物破胶酶的加入可以有效实现压裂液破胶降黏，由于生物酶的破胶作用彻底，实验岩心并未观察到显着的地层伤害（伤害率仅为11.37％），远低于对照组30.67％的伤害率，体现了生物酶破胶剂在中、低温油藏压裂施工作业中的良好应用前景。

4 结论

本研究采用响应面优化法获得了影响地衣芽孢杆菌BG1菌株发酵生产生物破胶酶的培养基组成中的显着因素，并通过建立多项数学模型，采用统计分析对模型进行显着性检验来优化发酵培养基。优化得到的最佳培养基组成为：4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。在优化的条件下，地衣芽孢杆菌BG1菌株的生物破胶酶活力达239U/L，表明采用响应面法优化发酵培养基组成是提高菌株产酶活性的有效途径之一，从而为该技术的推广奠定了较好的基础。该菌株产生的生物酶具有良好的稳定性，能够较好地耐受中低温和非极端pH环境，并较好耐受各种无机离子和化学助剂。通过对其破胶性能进行研究，发现该破胶酶能够有效降低压裂液黏度，破胶彻底，对地层伤害小，因此，本研究的研究成果在中、低温油藏压裂施工作业中有着良好的应用前景。

致谢 本研究工作是在中国石化前瞻性项目 “微生物降解压裂残渣和重烃研究” 资助下完成的。在研究中，李宗田教授，中国石化石油勘探开发研究院采油工程研究所苏建政所长和苏长明高级专家都给予了宝贵的指导和建议，对他们表示衷心的感谢。

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［11］徐兵威，王世彬，郭建春，等.低伤害压裂液体系伤害性研究与应用［J］.钻采工艺，2010，33（4）：87～89.

C. 关于酶的应用

酶在生产和生活中的应用
自19世纪末德国生物学家毕希纳（Edward
Buchner）证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶的名称以来，人类已经发现并鉴定出3000多酶。酶作为一种催化剂，已被广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程的迅猛发展，酶在生物工程、生物传感器、环保、医药等方面的应用也日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分，现实生活中，人们的衣、食、住、行及其他方面的新技术几乎都离不开酶。
常见的酶在生产和生活中的应用
洗涤剂工业：
（加酶洗衣粉等）碱性蛋白酶类
易于洗去衣物上的血渍、奶渍等污渍，加酶洗衣粉不能用于丝、毛等天然蛋白质纤维类织品的洗涤。
淀粉酶类
餐厅洗碗机的洗涤剂，用于去除难溶的淀粉残迹等
烘烤食品：
真菌产生的a一淀粉酶
催化淀粉降解成可被酵母利用的糖，面包等食品制作等
蛋白酶类（饼干松化剂）
制作饼干过程中，水解面粉中的蛋白质；乳制品生产中，水解乳清蛋白。有利于食品中蛋白类营养的消化吸收。
酿酒工业：
麦芽中的淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶。
将酿酒原料淀粉和蛋白质降解成能被酵母利用的单糖、氨基酸和肽，从而提高乙醇的产量。
β一葡聚糖酶
分解β-葡聚糖，降低麦汁粘度，加快麦汁过滤速度，避免因β-葡聚糖引起的啤酒混浊。
木瓜蛋白酶
去除啤酒储存过程中生成的混沌物
肉类烹饪：
木瓜蛋白酶（嫩肉粉）菠萝蛋白酶
分解肉的胶原蛋白，使肉类嫩滑。木瓜蛋白酶的最适宜温度为600C，适宜pH7-7．5，不要在高温和酸性环境下使用。
乳制品工业：
凝乳酶
奶酪生产的凝结剂，并可用于分解蛋白质。
乳糖酶
降解乳糖为葡萄糖和半乳糖，获得没有乳糖的牛乳制品，有利于乳品的消化吸收：
果汁生产：
果胶酶、纤维素酶。
处理果肉，提高出汁率、缩短出汁时间、提高果汁质量。
制糖工业：
淀粉酶等
将淀粉转化为葡萄糖及各类糖浆
葡萄糖异构酶
用于将葡萄糖转化为甜度高的果糖，生产高果糖浆。
纺织工业：
淀粉酶
广泛地应用于纺织品的褪浆，其中细菌淀粉酶能忍受100～110℃的高温操作条件。
纤维素酶
代替沙石洗工艺处理制作牛仔服的棉布，提高牛仔服质量。
制革工业：
胰蛋白酶类
除去毛皮中特定蛋白质使皮革软化，也可用于皮革脱毛。
医疗和药品工业：
胰蛋白酶
用于促进伤口愈合和溶解血凝块，还可用于去除坏死组织，抑制污染微生物的繁殖；
青霉素酰化酶
将易形成抗药性的青霉素改造成杀菌力更强的氨苄青霉素
L一天冬酰胺酶
用于治疗癌症，剥夺癌细胞生长所需的营养。
溶菌酶（黏多糖溶解酶）
破坏革兰氏阳性菌细胞壁而杀死细菌。抗菌、止血消肿、加快伤口愈合，也用于治疗鼻炎、咽喉炎、口腔溃疡等。
酪氨酸酶
生产（神经递质），多巴用于治疗帕金森综合症。
尿激酶、链激酶
溶血栓剂，治疗血栓病。
蛋白酶等（多酶片）
治疗消化不良，许多酶在医疗中还可作为诊断试剂。

D. 生物酶是什么，有什么用

生物酶是由活细胞组成的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，也有极少部分为RNA生物酶是具有催化功能的蛋白质。像其他蛋白质一样，酶分子由氨基酸长链组成其中一部分链成螺旋状，一部分成折叠的薄片结构，而这两部分由不折叠的氨基酸链连接起来，而使整个酶分子成为特定的三维结构。生物酶是从生物体中产生的，它具有特殊的催化功能，其特性如下：高效性：用酶作催化剂，酶的催化效率是一般无机催化剂的10^7~10^13倍。专一性：一种酶只能催化一类物质的化学反应，即酶是仅能促进特定化合物、特定化学键、特定化学变化的催化剂。

E. 油田用的压裂破胶剂有哪些哪种的比较好

根据井底温度预测的结果定的，一般0.025-0.07%之间，可以做实验或者经验判断，以尽量达到压后同步破胶，压裂液容易返排

F. 生物酶的应用

1、漆酶在纺织加工中的应用：漆酶是一种氧化还原酶，诺和信公司的Denilit II S就是通过基因改性的黑曲霉漆酶，可以进行牛仔服装仿旧整理工艺，获得的织物手感厚实，表面光洁、凭证、色泽明快、淡雅。
2、葡萄糖氧化酶在纺织加工的应用：葡萄糖氧化酶主要进行织物的漂白整理，这种酶处理对双氧水的产生非常有效，处理使不需添加双氧水稳定剂，处理后织物手感柔软、丰满。
3、半纤维素酶、木质素酶在纺织加工中的应用：天然的纤维素纤维中均含有半纤维素和木质素，尤其是麻类纤维含量较高，不去除半纤维素和木质素，极度影响纤维的可纺性能，通过半纤维素酶和木质素酶处理，可以大部分清除半纤维素和木质素，但半纤维素酶和木质素酶还没有在纺织工艺中单独使用，主要是和其他酶制剂（如果胶酶、纤维素酶等）配合进行纤维处理。
新型酶在纺织加工中的应用：化学合成纤维和浆料在纺织中的地位是明显的，这些高分子聚合物不能进行生物分解和降解，造成环境的污染，目前研究人员正在研究新的酶种，通过筛选具有某种功能的菌种，进行基因改性成为高性能酶剂或通过克隆、转基因或的基因工程菌，制出新酶种，或根据化学生物结构和酶学原理定向合成新型酶剂等。这些新型酶剂成为仿酶，目前较成功的酶包括PVA分解酶、涤纶分解酶、分解锦纶寡聚物的基因工程菌、合成酶等。 在石油钻井过程中，钻井液发挥着防止井壁渗漏和保护油气层的双重作用。但这两大作用有时却存在着尖锐的矛盾。当钻井遇到油气富集地层时，地层特点多不稳定，极易发生漏失、坍塌等复杂情况，此时钻井液的护壁防漏功能显得尤为重要。而普通钻井液要起到很好的护壁防漏作用，就必须提高其固相含量和粘度，但这样又会带来污染油气层的现象。如何才能既治理好井壁漏失坍塌的毛病、又有效保护好油气层，早已成为我国石油钻井领域的一大难题。
据胜利油田钻井工程技术公司首席科学家郭宝雨介绍，刚刚通过鉴定的新型钻井液体系能够在井壁上形成薄而坚韧的隔膜，这种隔膜的渗透性极低，在近井壁形成了一个渗透率几乎为零的护壁层，达到了维护井壁稳定的良好效果。
随着时间的推移，在需要打开油气层时，生物酶开始发挥它的生物降解作用，把原来坚韧致密的护壁薄膜一点一点破除，而这时，活性生物酶慢慢进入储层，在岩石表面油膜下生长繁殖，使原油从岩石表面剥离，从而被驱出；同时，它还能够降解原油，增强原油流动能力，从而在根本上实现提高原油采收率的目的。
据悉，这一体系在曲堤油田、淮北以及吉林等油田共34口井进行的现场试验表明，其原油采收率平均提高25%以上，地层渗透性恢复到90%以上，在解放油气层、保护油气层方面有着广阔的发展前景。

G. 生物酶的作用特点 给大家介绍一下

1、其特性如下：高效性：用酶作催化剂，酶的催化效率是一般无机催化剂的10^7~10^13倍。

2、专一性：一种酶只能催化一类物质的化学反应，即酶是仅能促进特定化合物、特定化学键、特定化学变化的催化剂。

3、生物酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，也有极少部分为RNA。

4、生物酶的制造和应用领域逐渐扩大，生物酶在纺织工业中的应用也日臻成熟，由过去主要用于棉织物的退浆和蚕丝的脱胶，至现在在纺织染整的各领域的广泛应用，体现了生物酶在染整工业中的优越性。

5、酶在人体皮肤护理领域也于2016年获得了重要突破，已进入临床应用阶段。

H. 除胶剂使用时应注意哪些问题旭升

除胶剂注意事项
1.产品有挥发性，要用塑料桶盛装，浸泡时盖好盖子。
2.产品有可燃性，不要靠近火源。
3.产品有腐蚀性，要戴劳保用品进行操作。如不慎沾到皮肤上，立即用水冲洗。
除胶剂使用说明
本产品可采用浸泡法和擦拭法进行除胶.浸泡十分钟~3小时后，取出工件，再用棉布或软毛刷将粘胶剥离擦除。
(本产品原液使用，严禁加水。)
适用于金属表面，塑料表面，玻璃表面等的清洗和光亮，可以高效清除其表面的松香焊药，吸塑胶以及墙上粘贴的胶纸，并且有很好的光亮效果。对表面的深层顽固污渍的清除有特效。
现在市面上的除胶剂，洗胶水都是化学成份，化学制剂基本上都会对人体器官生产损害。一般环保除胶剂对皮肤接触类是没有什么问题的，但不能误食以及接触皮肤有破损地的方。
1、氧化破胶剂
常用的氧化破胶剂有过硫酸钾、过硫酸铵等。由于氧化剂的活性和温度有关，一般当地层温度低于49℃时，反应的速度就很慢，需要加入活化剂。
氧化破胶剂有很多的缺陷如:①在高温下与压裂液反应迅速，使压裂液提前降解而失去输送支撑剂的能力，甚至导致压裂施工失败;②它属于非特殊性反应物，能和遇到的任何反应物如管材、地层基质和烃类等发生反应，生成与地层不配伍的污染物，造成地层伤害; ③氧化破胶剂很可能在到达目的裂缝前就消耗尽了，因而达不到破胶的目的。
2、胶囊氧化破胶剂
胶囊氧化破胶剂是把过氧化物单独装在合成外壳内。胶囊氧化破胶剂的核心材料为破胶剂，可采用与水接触即可溶解变为高活性的固体强氧化剂。胶囊氧化破胶剂的优点在于减少了破胶剂对压裂液流变性能的影响;增大破胶剂用量，改善了支撑裂缝的导流能力。
3、常规酶破胶剂
酶是具有高催化能力和很好的活性的生物蛋白，它在催化反应时自身的形态和结构不发生改变，因此可再催化另一个反应。常规酶破胶剂是半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物，它无法降解特定的聚合物，达不到理想的破胶效果。
另外，常规酶破胶剂虽然在低温下是一种较好的压裂液破胶剂，但它要求较低的pH值。一般酶在pH=6 时活性最大，高温、高pH值会使酶失去活性。
4、特异性酶破胶剂
针对于此，新型特异性生物酶破胶体系在其使用温度范围、pH范围等深入研究，主要针对多糖聚合物糖的甙键筛选特异性水解酶(LSE)，它们只分解多糖聚合物结构中特定的糖甙键，可将聚合物降解为非还原性的单糖和二糖。这些特异性破胶酶主要有纤维素糖甙键特异性酶、淀粉糖甙键特异性酶、胍胶糖甙键特异性酶等等。

I. 酶在轻工化学工业方面的应用

1．可广泛应用与制革、毛皮、毛纺、绢纺、造纸、洗涤剂、食品加工、医药、天然橡胶等的脱脂加工。
2．作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶一起添加于洗衣粉中制成双酶洗衣粉。产品市场及经济效益分析：以洗涤剂为例，目前欧洲各国市场加酶洗涤剂占有量已达90%，日本为80%(主要是蛋白酶和纤维素酶)，而我国仅占10%，且只添加单一的蛋白酶，故本品可填补国内复合洗涤剂的空白，并有希望打入国际市场。按年产 3000吨计，年产值可达1000万元，预测年效益可达200万元。
3.酶在生物工程、生物传感器、环保、医药等方面的应用也日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分，现实生活中，人们的衣、食、住、行及其他方面的新技术几乎都离不开酶。
4.真菌产生的a一淀粉酶 催化淀粉降解成可被酵母利用的糖，面包等食品制作等
蛋白酶类（饼干松化剂） 制作饼干过程中，水解面粉中的蛋白质；乳制品生产中，水解乳清蛋白。有利于食品中蛋白类营养的消化吸收。
5.酿酒工业：
麦芽中的淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶。 将酿酒原料淀粉和蛋白质降解成能被酵母利用的单糖、氨基酸和肽，从而提高乙醇的产量。
β一葡聚糖酶 分解β-葡聚糖，降低麦汁粘度，加快麦汁过滤速度，避免因β-葡聚糖引起的啤酒混浊。
木瓜蛋白酶 去除啤酒储存过程中生成的混沌物
6.肉类烹饪： 木瓜蛋白酶（嫩肉粉）菠萝蛋白酶 分解肉的胶原蛋白，使肉类嫩滑。木瓜蛋白酶的最适宜温度为600C，适宜pH7-7．5，不要在高温和酸性环境下使用。
7.乳制品工业：
凝乳酶 奶酪生产的凝结剂，并可用于分解蛋白质。
乳糖酶 降解乳糖为葡萄糖和半乳糖，获得没有乳糖的牛乳制品，有利于乳品的消化吸收：
果汁生产： 果胶酶、纤维素酶。 处理果肉，提高出汁率、缩短出汁时间、提高果汁质量。
制糖工业： 淀粉酶等 将淀粉转化为葡萄糖及各类糖浆
葡萄糖异构酶 用于将葡萄糖转化为甜度高的果糖，生产高果糖浆。
8.纺织工业：
淀粉酶
广泛地应用于纺织品的褪浆，其中细菌淀粉酶能忍受100～110℃的高温操作条件。
纤维素酶 代替沙石洗工艺处理制作牛仔服的棉布，提高牛仔服质量。
制革工业： 胰蛋白酶类 除去毛皮中特定蛋白质使皮革软化，也可用于皮革脱毛。
9.医疗和药品工业： 胰蛋白酶 用于促进伤口愈合和溶解血凝块，还可用于去除坏死组织，抑制污染微生物的繁殖；
青霉素酰化酶 将易形成抗药性的青霉素改造成杀菌力更强的氨苄青霉素
L一天冬酰胺酶 用于治疗癌症，剥夺癌细胞生长所需的营养。
溶菌酶（黏多糖溶解酶） 破坏革兰氏阳性菌细胞壁而杀死细菌。抗菌、止血消肿、加快伤口愈合，也用于治疗鼻炎、咽喉炎、口腔溃疡等。
酪氨酸酶 生产（神经递质），多巴用于治疗帕金森综合症。
尿激酶、链激酶 溶血栓剂，治疗血栓病。
蛋白酶等（多酶片） 治疗消化不良，许多酶在医疗中还可作为诊断试剂。

J. 油田用的压裂破胶剂有哪些哪种的比较好

常用的破胶剂有过硫酸铵、过硫酸钠、生物酶和其他过氧化物。最经济，最常用的是过硫酸铵。用在植物胶类压裂液上。