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微生物酶制剂生产技术
项目介绍：
由于酶作用的特异性强、反应条件温和、安全性大、污染环境小，因此随着人们对健康、环保要求的增高，微生物生产的酶制剂将更需发展，酶制剂工业大有可为。其主要使用领域约：食品占45%、洗涤剂34%、纺织10%、造纸3%、诊断药用等6%。本种酶制剂生产技术使用筛选所得枯草芽孢杆菌，利用淀粉质原料发酵生产淀粉酶、蛋白酶和半纤维素酶，菌种性能稳定，发酵活力高。发酵液通过不同路径的后提取工艺可得到不同使用级别的酶制剂产品。可提供菌种及工厂设计和工艺技术。
项目类别：新工艺
技术成熟程度：已产业化
知识产权状况：属实用新型专利
服务方式：合作开发、技术转让、合作办厂、技术服务、交钥匙工程、其它
投入产出效益分析：投资费用可根据生产规模定。
生 产 技 术
酶制剂是由微生物产生的生物产品，其生产过程是大规模生产技术应用过程，由三大工序组成：发酵、提取、造粒。
发 酵
微生物经过DNA技术的重组，变成高效的特定酶制剂的生产菌，生产菌在丹麦批量生产并冷藏，使用前，首先要经过实验室的扩大培养，然后接入发酵车间内的种子罐进行再次扩大培养，最后扩大培养后的生产菌进入发酵罐开始酶制剂的人工化生产。生产菌在大型的不锈钢发酵罐内得到充分的养分和空气，在最适合的环境中迅速成长，同时产出大量的生物酶。整个发酵过程都是由计算机自动控制完成的，发酵所用的原料主要是农产品，发酵的整个过程完全符合GMP的要求。
提 取
提取过程的主要任务是从发酵液中提取酶。这是由许多过滤和浓缩步骤完成的。首先发酵液经初步过滤后，变成澄清的含有酶的滤液，此时的滤液经进一步过滤，去除大量的水份和小分子物质后变成酶的浓缩液。如果需要，酶的浓缩液可被进一步浓缩。对于以液体出售的酶产品，提取的最后步骤是标准化和稳定化。整个提取的生产过程完全符合GMP的要求。
造 粒
固体酶（颗粒酶）广泛应用于洗涤行业和纺织行业中。目前诺维信中国采用了全自动控制的先进特体流化床工艺来生产固体颗粒产品。在流化床中，来自提取工艺的浓缩液被以雾状形式喷到载体表面，并得到热空气的干燥。酶层以外，另有两层包膜被以同样的工艺过程包裹在含酶颗粒的外层，从而最终得到了自由流动，无粉尘，使用安全方便的固体颗粒产品。
众所周知，21世纪最具发展潜力的两大产业是信息技术（IT）和生物技术。信息技术发展迅猛，并已渗透到社会生活的各个角落。有关信息技术的报道——多媒体、互联网、信息全球化等，不但频频亮相于媒体，而且与我们的日常生活息息相关。而与IT的轰轰烈烈相比，生物技术看起来却平平淡淡，虽然基因、克隆、人类基因组计划、生物多样性等字眼经常见诸报端，但离我们的生活似乎还很遥远。所以，也有专家这样评论：20世纪不是生物技术的世纪，而是生物工程蓄势待发的世纪，21世纪才是生物工程的世纪。克隆羊多利的诞生，人类基因组90％测序工作的完成，欧美、日本等发达国家对生物技术产业投资的逐年加大，世界各大公司生命科学产业的合并浪潮一浪高过一浪，所有这一切，都使我们相信，21世纪的的确确是生物技术的时代。
生物化学工程（又叫生化工程或生物化工）是化学工程与生物技术相结合的产物。生物化工是生物技术的重要分支。与传统化学工业相比，生物化工有某些突出特点：①主要以可再生资源作原料；②反应条件温和，多为常温、常压、能耗低、选择性好、效率高的生产过程；③环境污染较少；④投资较小；⑤能生产目前不能生产的或用化学法生产较困难的性能优异的产品。由于这些特点，生物化工已成为化工领域重点发展的行业。
1.世界生物化工行业的现状
生物化工发展至今已经历了半个多世纪，最早主要是生产抗生素；随后，是为氨基酸发酵、舀体激素的生物转化、维生素的生物法生产、单细胞蛋白生产及淀粉糖生产等工业化服务。自20世纪80年代起，随着现代生物技术的兴起，生物化工又利用重组微生物、动植物细胞大规模培养等手段生产药用多肽、蛋白、疫苗、干扰素等。而且，生物化工的应用已涉及到人民生活的方方面面，包括农业生产、化轻原料生产、医药卫生、食品、环境保护、资源和能源的开发等各领域。随着生物化工上游技术——生物工程技术的进步以及化学工程、信息技术（IT）和生物信息学（bioinformatics）等学科技术的发展，生物化工将迎来又一个崭新的发展时期。
生物化工行业经过50多年的发展，已形成了一个完整的工业体系，整个行业也出现了一些新的发展态势。下面简要描述生物化工行业的现状。
1．1工业结构
由于生物化工涉及面广，涉及的行业多，所以从事生物化工的企业较多。据报道，90年代中期，美国生物化工企业有：000多家，西欧有580多家，日本有300多家。近年来，虽然由于行业竞争日趋激烈，生物化工企业有较大幅度减少，但与生命科学（主要指医药和农业生化技术）诸侯割据的局面相比，生物化工行业依然是百花齐放，百家争鸣。既有象诺华、捷利康等从事生命科学的世界性大公司，也有象DSM、诺和诺德等大型的精细化工公司，当然也有在某一方面有专长的小公司如Altus等。而且，由于世界大公司正把注意力向生命科学部分转移，生物化工行业百花齐放的局面在很长一段时间内不会有什么改变。
1．2产品结构
传统的生物化工行业主要是指抗生素（如青霉素等）、食品（如酒精、味精等）等行业，而在目前，它已几乎渗透到人民生活的各方面如医药、保健、农业、环境、能源、材料等。同时，生物化工产品也得到了极大的拓展：医药方面有各种新型抗生素、干扰素、胰岛素、生长激素、各种生长因子、疫苗等；氨基酸和多肽方面有赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸等以及各种多肽；酶制剂有160多种，主要有糖化酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、青霉素酶、过氧化氢酶等；生物农药有Bt、春日霉素、多氧霉素、井岗霉素等；有机酸有柠檬酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、延胡索酸、已二酸、脂肪酸、卜酮戊二酸、l亚麻酸、透明质酸等。还有微生物法1，3．丙二醇、丙烯酞胺等。
目前，全球生物化工年销售额在400亿美元左右，每年约以7％～8％的速率增长。从产品结构来看，生物化工领域生产规模范围极广，市场年需求量仅为千克级的干扰素、促红细胞生长素等昂贵产品（价格可达数万美元／g）与年需求量逾万吨的抗生素、酶、食品与饲料添加剂、日用与农业生化制品等低价位产品（部分价格不到：美元／g）几乎平分秋色。高价位的产品市场份额在50％～60％，低价位的产品市场份额在40％～50％。而且，根据近年来生物化工的发展趋势及人们对医药卫生的重视来看，高价位产品的发展速率高于低价位产品。
1．3技术水平
生物化工经过80年代以后的蓬勃发展，不仅整个行业技术水平有大幅度提高，而且许多新技术也得到广泛应用。
1．3．1发酵工程技术已见成效
据估计，全球发酵产品的市场有120～130亿美元，其中抗生素占46％，氨基酸占16.3％，有机酸占13．2％，酶占10％，其它占14．5％。发酵产品市场的增大与发酵技术的进步分不开。现代生物技术的进展推动了发酵工业的发展，发酵工业的收率和纯度都比过去有了极大的提高。目前世界最大的串联发酵装置已达75m＼许多公司对发酵工艺进行了调整，从而降低了生产成本。如ADM（ArcherDanie1sMid1and）和Cargill公司在20世纪90年代初对其发酵装置进行改造，将以碳水化合物为原料的生产工艺改为以玉米粉为原料，从而降低了生产成本，ADM公司生产的赖氨酸成本比原先降低了一半。
1．3．2酶工程技术有了长足的进步
酶工程技术包括酶源开发、酶制剂生产、酶分离提纯和固定化技术、酶反应器与酶的应用。目前世界酶制剂从酶源开发到酶的应用都已进入了良性发展阶段，各阶段生产企业和用户关系密切，合作广泛。据报道，1998年全球工业酶制剂的销售额为13亿美元，预计到2010年将增长到30亿美元，每年以6．5％的速率增长。其中食用酶占40％，洗涤用酶占33％，其它（主要是纺织、造纸和饲料等用酶）占27％。
1．3．3分离与纯化技术也有很大进步
影响生化产品价格的因素，首当其冲的是分离与纯化过程，其费用通常占生产成本的50％～70％，有的甚至高达90％。分离步骤多、耗时长，往往成为制约生产的“瓶颈”。寻求经济适用的分离纯化技术，已成为生物化工领域的热点。已大规模应用的分离纯化技术有：双水相革取、新型电泳分离、大规模制备色谱、膜分离等。
1．3．4上游技术广泛应用于下游生产
利用基因工程技术，不但成倍地提高了酶的活力，而且还可以将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因菌产生酶。利用基因工程，使多种淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、氨基酸合成途径的关键酶得到改造、克隆，使酶的催化活性、稳定性得到提高，氨基酸合成的代谢流得以拓宽，产量提高。随着基因重组技术的发展，被称为第二代基因工程的蛋白质工程发展迅速，显示出巨大潜力和光辉前景。利用蛋白质工程，将可以生产具有特定氨基酸顺序、高级结构、理化性质和生理功能的新型蛋白质，可以定向改造酶的性能，从而生产出新型生化产品。
1．3．5新技术在生物化工中也得到了极大的应用
比如，在超临界液体状态下进行酶反应，从而大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率。超临界C02无毒、不可燃、化学情性、易与反应底物分离。利用超临界CO2取代有机溶剂进行酶反应，具有极大的发展潜力。又比如，微胶羹技术已被广泛用于动物细胞的大规模培养、细胞和酶的固定化以及蛋白质等物质的分离方面。
2．世界生物化工行业的发展趋势
2．1工业结构
行业与行业间的划分将日趋模糊，企业间的合作将加大。目前，许多从事医药、农业、环境、能源等方面生产的企业，正在从事生物化工生产。特别是某些从事传统化工行业的生产厂家，也纷纷涉足生物化工领域。如杜邦公司，长期以来主要从事有机化工和聚合材料的生产，现在正加大生物化工的开发力度，已开发成功了生物法生产1,3-丙二醇工艺，并正在开发用改性大肠杆菌生产己二酸工艺。DSM公司以前主要从事抗菌素方面的生产，现也加大了生物化工的投资力度。
由于生物化工涉及面广，许多生化公司都有自己的专长，它们之间为了商业利益的合作也非常活跃。此外，随着从事传统行业的生产厂家的加入，由于技术与生产方面的原因，它们与从事生物化工开发与生产的企业合作也很频繁。所有这一切，都使生物化工行业的合作越来越广泛。如杜邦公司与杰宁科乐公司合作开发用生物法生产1，）丙二醇，进一步生产PTT树脂。荷兰的Purac公司与美国Cagill公司合资建设年产3．4万tL。乳酸装置，并计划进一步发展到6．8万V入DSM公司与美国Maxygen公司签定了三年的研究合同，以利用Maxygen的
DNA重排和分子培养技术，开发在7一ADCA和其它青霉素生产中使用的酶和菌种。
2．2产品结构
生物化工产品正向专业化、高科技含量、高附加值方向发展。传统的低价位产品受到冷落，而高价位产品如生化药物、保健品、生化催化剂等则备受青睐。许多公司为了追求较高利润，都将低附加值的产品剥离。如日本武田药品工业公司不再生产味精，转而生产其它高附加值的调味品如肌甘酸二钠（IMP）和鸟甘酸二钠（GwtP）。另外，生物化工将涉足它以前很少涉足的领域如高分子材料和表面活性剂等。
生化药物由于附加值高而成为今后生物化工领域发展的重点。1997年生化药物市场销售额达130亿美元，其中细胞分裂素80亿美元，激素30亿美元，其它20亿美元；就具体药物而论，促红细胞生长素35亿美元，人胰岛素18亿美元，粒性白细胞克隆刺激因子16亿美元，人生长激素15亿美元，小干扰素11亿美元。预计今后其市场销售额还将以8％的速率增长。
在氨基酸方面，虽然用于药物合成氨基酸的量相对较小，但其发展潜力很大。据报道，500种主要药物中，有18％含有氨基酸或其衍生物的合成。在药物合成中，使用最广泛的是L。脯氨酸、r苯甘氨酸和r对羟基苯甘氨酸。L。脯氨酸用于血管紧张素转化酶（ACE）的合成，匹苯甘氨酸和r对羟基苯甘氨酸用于抗生素的合成。另外，多肽也是今后的发展重点之一。多肽是指有2以上氨基酸用肽键组成的化合物，在临床上使用非常广泛，主要用于治疗癌症、HIV病毒和兔疫系统功能减退、对传统抗生素产生抗体的感染以及疫苗等。全球合成多肽原药的产量在100kg左右，但销售额达2．5亿～3亿美元，而做成制剂的销售额则达25亿～30亿美元。多肽原药需求量的年增长率在10％以上。
碳水化合物方面，用于临床的碳水化合物受到人们越来越多的关注。但是，用于临床的碳水化合物结构复杂，如一对单糖，其不同的化学键就多达22种。因此，用化学法合成复杂的碳水化合物比较困难，难以实现工业化，而用酶法合成则是一条切实可行的途径。
作为生化催化剂的酶，也将是今后发展的重点。1997年，生化用催化剂销售额约1．3亿美元，在过去的3～5年间，每年增长速率在8％～9％，预计在未来的3～5年间，将以同样速度增长。生化催化剂主要用于手性药物的合成。当前，手性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一。
1997年手性药物制剂世界市场的销售额为879亿美元，占药品市场的28．3％，到2000年将达到900亿美元。在未来的25年内，约有一半的手性药物要通过生化催化合成，因此，生化催化剂无论从需求量和需求种类来看，都具有很大的发展潜力。
生化表面活性剂由于具有无毒、生物降解性好等优点，今后可能成为表面活性剂的升级换代产品，但目前还处于探索阶段。
生物化工在高分子材料、特殊化学品、生物晶片、环保等方面也将有极大的发展潜力。
2．3技术水平
不断提高菌株活力、发酵水平、生化反应过程、分离纯化水平，依然是生物化工面临的课题。
在菌种开发方面，由于从20世纪70年代以来从自然界中筛选菌种以获得新的代谢产物的机会明显减少，人们便考虑利用已知菌种经适当改变其代谢特性后生产新的产品。如日本协和发酵公司已成功地把生产谷氨酸的菌种改为生产色氨酸。
在生化反应器方面，反应器放大一直是一个老大难的问题。因此，利用计算机技术对整个生化反应过程进行数字化处理，从而优化反应过程，是今后的发展方向之一。
在分离纯化方面，亲和层析受到广泛重视，并有人研制了一种综合专家系统软件包，可在几分钟内告知对方被分离物系的分离方法和顺序，以便根据产品所需进行取舍。
另外，在生化过程的在线检测和控制方面，利用生物传感器和计算机监控，依然是今后的发展方向。
在酶催化反应中将发展有机溶剂中的催化反应。
生物上游技术的发展，将对生物化工产生深远影响。人们对从病毒、细菌、植物、动物到人类基因组顺序测定工作十分重视，并在此基础上形成了基因许多产品一哄而上，盲目上马，遍地开花，最终形成恶性竞争，许多企业破产倒闭。在竞争中生存下来的企业，也是元气大伤，难以进一步组织技术改造。如仅江苏省停产的发酵生产线就多达上百条。另外，行业内企业间的生产水平相差悬殊，企业技术装备水平达到20世纪80年代以后国际先进水平的仅占20％～30％，多数处于20世纪60～70年代水平。
二是产品结构不合理，品种单一，低档次产品重复生产，不能适应需求。在我国高档的医药生化产品如激素、生长因子、干扰素、药用多肽等，有的产量很小，有的没有生产，因此每年都需进口。
三是在生产技术上，工艺、设备不配套，上下游技术不配套，产物的收得率低。我国虽然某些产品如柠檬酸、乳酸等发酵水平较高，但大多数产品的收率都低于国外，酶制剂的活力也明显低于国外，生化反应器和分离纯化技术更是落后国外15～20年。每年都要花费大量资金从国外进口生物反应器、细胞破碎机、分离纯化设备及分离介质、生物传感器和计算机监控设备。
四是有些产品投入产出比达15／＝以上，造成严重的资源浪费和环境污染。
五是基础研究薄弱，技术创新能力不强，企业的技术开发、技术吸收能力差，生产发展多数依靠传统的夕蜒型、粗放型扩大投资的增长模式，效益低、市场竞争力低。
3．2建议针对我国生物化工行业存在的问题，笔者有以下建议：
3．2．1扩大经济规模，提高竞争力要鼓励建设大型的生物化工企业集团公司，使之集科研、开发、生产、销售干一体。尤其要培育一批科技创新型企业。同时，也要鼓励在某些方面有一定特色的小型技术创新型生化公司的发展，并淘汰一批生产规模小、生产技术落后、没有市场竞争力的企业，从整体上优化我国生物化工的产业结构。
3．2．2调整产品结构要发展高档产品，如高档医药生化产品、功能性食品及添加剂（主要有低热值、低胆固醇、低脂肪、提高免疫功能、抗炎、抗癌等产品）、生化催化剂等。另外，也应发展众多精细化工产品及用化学法无法生产或很难生产的产品，如微生物多糖、生物色素、工业酶制剂、甜味剂、表面活性剂、高分子材料等。
3．2．3节约有限资源，强化环境保护在生化生产组学（genomics）。近年来又在信息学（informatics）的基础上建立了生物信息学（bioinformatics）。信息学的内容包括信息科学十生物技术十生物工程十生物动力学等的综合信息系统。可以预见，基因组学和生物信息学在生物化工中应用的商业前景极为可观。
另外，其它行业的新技术如分子蒸馏技术、组合化学（combinatoricalchemistry）等，也将在生物化工中得到应用。
3.我国生物化工的发层现状及建议
3．1发展现状
我国生物化工行业经过长期发展，已有一定基础。特别是改革开放以后，生物化工的发展进入了一个崭新的阶段。目前生物化工产品也涉及医药、保健、农药、食品与饲料、有机酸等各个方面。
在医药方面，抗生素得到迅猛发展61998年我国抗生素的产量达到33486h青霉素的产量居世界首位。其它生化药物中，初步形成产业化规模的有干扰素、白细胞介素。2、乙型肝炎工程疫苗。
在农药方面，生物农药品种达12种，主要有苏云金杆菌、井岗霉素、赤霉素等。其中，井岗霉素的产量居世界第一位。
在食品与饲料方面，作为三大发酵制品的味精、柠檬酸、酶制剂的产量也有很大的增加／1998年味精产量从1990年的22．3万、增加到56．4万一柠檬酸产量从1990年的6．13万、增加到56．4万一酶制剂从1990年的8．5万t增加到24万t。酵母及淀粉糖的产量也有明显增加。我国的味精生产和消费居世界第一，柠檬酸的生产和出口也居世界第一。另外，1998年乳酸的产量在1．5万t左右，赖氨酸的产量在2万t左右，卜苹果酸的产量在6000t。
在有机酸方面，衣康酸的产量达5000乙我国开发的生物法长链二元酸工艺居世界领先地位，目前生产能力达500Va以上，并有数家企业有建设长链二元酸生产装置的意向。
在保健品方面，我国已能用生物法生产多种氨基酸、维生素和核酸等。另外，我国生物法丙烯酞胺的生产能力达到2万V山与日本同处于世界领先地位。
但是与发达国家相比，我国生物化工行业存在着许多问题：
一是我国的生物化工产业主要以医药、轻工、食品业为主。部分企业对生物化工产品大都是精细化工产品这一点了解不够，加之行业规范也不够，导致过程中，应选择合适的原料，以降低成本与消耗，并加强废物处理，减少环境污染。
3．2．4提高生产技术水平，特别是下游技术水平因为我国生物技术上游技术水平与国外相差仅3～5年，而下游技术水平则比国外相差15年以上，改造传统发酵产品生产技术，不断提高发酵法产品的生产技术水平，开发生物反应器，提高我国生物化工产品分离和提纯技术，大规模开发生物化工装备等应首先提上议事日程。另外，还应积极采用微生物法代替化学法，开发基础化工新产品的工业化生产技术。
3．2．5加强产学研结合，注重上下游结合国内生物化工技术力量分散，为了做到优势互补，应加强产学研结合。另外在生物化工生产过程中遇到的很多问题，都是由于上、下游结合不够紧密而影响技术经济指标。因此，在人力和财力的投入上，应考虑上下游结合，以加快生物化工产业的发展。
3．2．6提高从业人员素质生物化工属高科技产业，从业人员素质尤其重要。我国目前从事生物化工生产的大都是传统化工行业的从业人员，操作水平还比较低，加强人材培养，以提高生物化工行业人员素质是十分必要的。
3．2．7加强知识产权保护长期以来，我国对生化领域的知识产权保护不够，挫伤了科研开发人员的积极性，造成大量人才外流。加强知识产权保护，不仅能够激励国内科研开发人员，而且能够吸收一大批在国外发展的科研人员回国发展，从而加快我国生物化工产业的发展。
B. 提取酶的方法有哪些
酶是蛋白质，可以根据其特点选择适当的蛋白质提取纯化方法！
选择材料及预处理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化
一，蛋白质（包括酶）的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径
XM－300
300，000
140
XM－200
100，000
55
XM－50
50，000
30
PM－30
30，000
22
UM－20
20，000
18
PM－10
10，000
15
UM－2
1，000
12
UM05
500
10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。
二、干燥
生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
三、贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。
C. 从组织细胞中获得酶的粗提取样品常有哪些方法
从动物胰脏中提取胰蛋白酶,一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右）,使大量的酸性蛋白沉淀出来.经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀.沉淀物经水溶解并调至pH8.0,用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活,同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活,三种酶原相互作用过程如下：
也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原,利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶,并通过溶液中Ca2+的环境,使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活,转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）.
激活后的酶溶液再进一步分离纯化.
〔试剂和器材〕
1、试剂
（1）pH2.3.0乙酸化的水溶液
（2）10%（体积分数）乙酸
（3）2mol/L硫酸
（4）固体硫酸铵
（5）无水CaCl2
（6）结晶胰蛋白酶
（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl2)
（8）95%（体积分数）乙醇
（9）5mol/L NaOH
（10）丙酮
2、器材
（1）胰脏
（2）组织捣碎机
（3）离心机
（4）磁力搅拌器
（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅
（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗
（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等
〔方法和步骤〕
方法一
1、 胰蛋白酶原的提取
取新鲜胰脏约150g,剥去结缔组织和脂肪,取净重100g,切成碎块,在组织捣碎机中捣碎,并加入2倍体积预冷的pH2.3.0乙酸化水溶液,制成匀浆.浆液倒入500mL烧杯中,用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.3.0之间,在5～10℃下提取6h以上,并间隙轻轻搅拌.用4层纱布过滤,尽量挤出滤液.组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h）,再用4层纱布过滤.合并两次滤液,用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.3.0之间,4℃放置4h（pH始终保持在2.3.0）,使提取液中酸性蛋白沉淀析出.提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤,收集滤液,量取体积（约200mL左右）.
滤液中加入粉末状固体硫酸铵,使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492g,5℃）.放置过夜,使胰蛋白酶原完全析出.次日抽滤,弃滤液,压紧并收集滤饼,即胰蛋白酶原粗品.
2、 胰蛋白酶原的激活
将胰蛋白酶原粗品称重（湿重）,分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算）,使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）.用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0,慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）.取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,25℃放置2～4h,或4℃放置12～16h,使胰蛋白酶原活化.每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况,直至酶激活速度变慢或停止增长.一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg.留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.3.0,滤纸过滤,滤去硫酸钙沉淀,收集滤液,4℃保存备用.
方法二
称取冷冻猪胰脏100g,在2～5℃下解冻,切成小块,用组织捣碎机中绞碎成胰浆,在5～10℃存放24h以上,使胰酶自身活化.胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2）,捣碎机中捣碎1min.胰浆倒入500mL烧杯中,间隙搅拌,温度20℃左右,活化5～6h.每隔1.5h,吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.
活化反应结束后,胰浆3 500 r/min离心20min,将离心后上清液用二层纱布过滤.滤液置250mL烧杯中,以过滤清液的体积为准,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使溶液硫酸铵饱和度为20%.放置 6h后,3 500 r/min离心20min,保存上清液待用,取沉淀.沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤,再用丙酮洗涤,过滤.最后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅰ.
在上述离心上清液中,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度,放置 6h后,3 500 r/min离心30min,取离心沉淀,分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤,过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅱ.
D. 食用酶是如何进行工业制取的酶的种类很多，通过微生物发酵的技术能实现酶的提取吗
不管是不是食用酶，利用微生物发酵技术生产的生物酶，都可以通过工业化技术进行分离、提取、纯化，从而得到商品酶制剂。
酶一般并不直接食用，所以不叫“食用酶”。酶一般是作为食品生产过程中加入的一种助剂，在食品产品中一般已经没有具有活性的酶了，所以，这类作为助剂使用的酶一般叫做“食品用酶制剂”。
食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类，这就对酶的提取有了工艺技术上的要求。如果是胞外酶，一般是先对发酵液进行过滤，滤液中的酶可根据其等电点调整PH值使其沉淀。还有其他沉淀方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法、单宁沉淀法等。离心后得到粗提的酶，再溶解后，可重复上述步骤，使酶的纯度进一步提高。如果需要精制酶，还可通过层析、电泳、萃取等方法，对酶进行进一步提纯。有时，还要根据需要，进行脱盐、脱色处理。
然后，就是浓缩、干燥等工序，就可得到固态的酶制剂了。由于酶属于蛋白质，对温度比较敏感，在浓缩、干燥时，必须采用低温浓缩和低温干燥。同时，在整个提取和精制过程中，要避免重金属离子混入。
如果要提取的是胞内酶，要先进入细胞破碎，使细胞中的酶释放出来，再进行提取。
E. 怎样用微生物提取酶制取氢
用微生物提取酶制取氢主要有以下两种：
一是利用葡萄糖脱氧酶。美国橡树岭国家实验室从热源体乳酸菌中提取葡萄糖脱氧酶。热源体乳酸菌首先是在美国矿井中的低温干馏煤渣中发现的。葡萄糖脱氧酶在一种化学物质磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADP）的帮助下，能从葡萄糖中提取氢。在制取氢的过程中，NADP从葡萄糖中剥取一个氢原子，使剩余物质变成氢原子溶液。
二是利用氢化酶。这种酶是从曾在海底火山口附近发现的一种微生物中提取的。氢化酶的作用是使NADP携载的氢原子结合成氢分子，而NADP还原为它原来的状态再次被利用。
除美国发现这种酶外，俄罗斯的科学家也在湖沼里发现了这种微生物。他们把这种微生物放在适合它生存的特殊器皿里，然后用氢气瓶将微生物产生出的氢气收集起来。
F. 如何从重组大肠杆菌中提取出淀粉酶粗酶液
用转基因技术.
把人类的淀粉酶基因导入到大肠杆菌的基因组中.
大肠杆菌就可以通过转录翻译产生淀粉酶.
G. 鲫鱼肠道粗酶液的提取
1、首先粗酶提取液的制备取不同发酵阶段的发酵液40ml在4℃。
2、其次10000g条件下离心10min。
3、然后弃上清液，收集菌体即可。提取是通过溶剂（如乙醇）处理、蒸馏、脱水、经受压力或离心力作用，或通过其他化学或机械工艺过程从物质中制取有用成分（如组成成分或汁液）。
H. 微生物是怎么发酵得到酶的
一般都是发酵微生物，生产菌体和表达酶蛋白，提取酶蛋白。纯的酶都是经过特异工艺提取和纯化的。
I. 举例简述微生物酶开发的一般程序
我把你问题中的“程序”理解为“过程”。简单说一下。
以纤维素酶产生菌的筛选为例。
先找可能存在此类微生物的环境，如森林里的枯枝烂叶和腐质土。采好样品，拿回实验室，首先进行扩大培养。就是把样品中所有的微生物都培养增殖。一般就用全营养培养基。
培养液稀释不同倍数后，做平板单细胞培养，这时就要用到“筛子”了。对于纤维素酶产生菌，筛子可选用可溶性纤维素。平板培养时，用可溶性纤维素作唯一碳源，不产生纤维素酶的微生物就不能生长（或生长极弱），把生长良好的微生物挑选出来，再进行扩大培养，再用纤维素唯一碳源的培养基进行筛选，并挑选生长优势菌落，重复以上步骤（可以多挑选几支进行对比选择）。几次以后，用纤维素粉（不溶性的）做唯一碳源的培养基，进行平板培养，纤维素酶产生量越大、活性越高，产生的透明圈直径就越大。用这种办法可能对酶产生量大、活性高的菌种做进一步筛选。
其它目的微生物的筛选步骤也差不多。
关键是采样地点的选择和“筛子”的设计。
菌种筛选好后，一般是用正交实验确定培养基组成。先用单因素实验，再进行验证。在进行扩大实验前，可根据小试确定的培养基组成，用低成本原料进行替代性实验，以降低工业化生产时的生产成本。然后用小型发酵罐进行中试，进一步摸清产酶条件，如培养基组成、通风量、温度、发酵各阶段条件控制方式。。。。等等。就可以进行工业化生产了。在工业化生产时，在数十吨至百吨罐中，还要进行几次实验，进一步摸条件和条件控制。
在进行产酶微生物的筛选和发酵条件摸索的同时，还要对酶的提取技术进行研究，还要对酶的性质、最佳作用条件等进行研究，对研究出的工艺进行评价，以确定开发出的酶是否具有商业价值，以及商业价值的高低。
差不多就这样。
希望对你有用。