如何获得某生物cDNA

Ⅰ 从RNA抽提到制成cDNA的全过程

一).构建cDNA文库：
以生物细胞的总 mRNA 为模板，用反转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。

1、mRNA的提取及其完整性的确定
1） 总 RNA 的提取
RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA
2）mRNA的分离
高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。
3） mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4）mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。

2、 cDNA 的合成和克隆
1） cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
2）. 双链 cDNA 的合成
合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。
3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：
① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链；
② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；
③ 通过粘性末端连接。
4）. 转化
重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。
5）. 目的 cDNA 克隆的鉴定
用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种：
① 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择

Ⅱ 如何获得cDNA

cDNA的获取方法：
1.用亲和层析法得到
mRNA
后，根据
mRNA
分子的
3'
端有
poly
(A)
尾结构的原理，用
12~20
个核苷酸长的
oligo
与纯化的
mRNA
混合，
oligo
（
dT
）会与
poly
(A)
结合作为反转录酶的引物，随机引物法合成的产物也是
RNA-DNA
的杂交体。把
cDNA
克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的
RNA
转变成
DNA
链，即形成双链
DNA
分子。
2.利用
cDNA
第一链的
3'
末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，用这种方法合成的双链
cDNA
在一端有一个发夹环，可以用单链特异的
S1
核酸酶切去。新合成的
DNA
存在切口，用
DNA
连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的
DNA
链。
RNase
H
法优于
S1
核酸酶法，它能获得包括
mRNA
5'
端全部或绝大部分的更长顺序
cDNA
分子。
cDNA简介：
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary
DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA(基因组DNA，genomic
DNA)不同而无内含子;相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。

Ⅲ 反转录法获取cdna

因为直接从生物体中提取的基因的编码区是不连续的有不编码蛋白质的内含子部分，而反转录来的cDNA的编码区是连续的（成熟mRNA中的序列都是由基因的编码区的外显子部分转录来的），为了节省目的基因片段的长度，选择cDNA为目的基因。
怎么不给悬赏？

Ⅳ 如何根据真核生物蛋白质氨基酸的一级结构获得其cdna

大致试验步骤：1、由氨基酸序列即蛋白质免疫反应得体2、再将抗体与胞内核糖体（上的蛋白质）结合3、将核糖体上的蛋白质和mRNA拆分4、由MRNA逆转录cDNA

Ⅳ cDNA文库构建的方法与过程分别是什么

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合.经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库.其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心.由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要.在获得高质量的 mRNA 后,用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链, cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定.这里强调的是对载体的选择,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA.

Ⅵ pcr技术dna模板如何获得

有两种方法：

第一种从cDNA 文库(cDNA library )获得，如厦大韩家淮实验建立的免费cDNA 文库；

第二种从mRNA逆转录获得，在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来的基因组DNA相同而且无内含子；相反地，对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，与外显子序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。

真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

(6)如何获得某生物cDNA扩展阅读：

cDNA 文库(cDNA library ): 是指某生物某一发育时期所转录的mRNA 全部经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA 文库与基因组文库的最主要的区别是，基因组文库含有而cDNA 文库不含非转录的基因组序列(重复序列等)。

与基因组文库- 一样，cDNA 文库也是指一群含重组DNA 的细菌或噬菌体克隆。每个克隆只含一种mRNA 的信息，足够数目克隆的总和包含了细胞的全部mRNA 信息。cDNA 文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达。

不论是由细胞总DNA 建立的基因组文库，还是由mRNA 逆转录而成的cDNA 建立的cDNA 文库，都是混合物，还要对文库进行筛选，直到获得目的基因。

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

Ⅶ 如何根据真核蛋白的氨基酸序列获得其cDNA

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列，采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因，其中还含有内含子等无用的序列。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难.
高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子。cDNA文库是通过RNA反转录得来的，由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.

Ⅷ CDNA如何克隆

一般用mRNA反转录地方法得到cDNA
或者从文库里直接得到cDNA

之后用PCR就可以扩增 克隆

cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：

①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；

③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。

1.方法：

(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。

(2)载体DNA的选择：

①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。

M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。

③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。

(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

Ⅸ 如何进行目的基因和目的的cDNA的筛选

筛选一般用主要采用杂交技术(如Northen杂交、Southen杂交)，采用的是单链核酸间互补配对的原理，或者使用鸟枪法导入，看性状能否表达。
不知道据你要做什么
(一)从细胞核中直接分离
简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是:用限制酶(即限制性内切酶)将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
(二)染色体DNA的限制性内切酶酶解
II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。
(三)人工体外合成
简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。
(四)用逆转录酶制备cDNA
大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA(反转录DNA)得到。从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic
acid
,polyA)尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12-18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条
图10-39
目的

Ⅹ 从某一生物X基因克隆得cDNA,鉴定基因功能,写出实验方案

实验目的：从某一生物X基因克隆得cDNA
实验方法：1.抽取该生物的total RNA
2.用total RNA反转录得到total cDNA
3.设计引物，以total cDNA为模板，将目标基因PCR扩增出来
4.测序鉴定PCR产物