Ⅰ 求高中生物选修3知识点整理。。
生物选修3知识点
专题1 基因工程
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
（一）基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
(二)基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
（三）基因工程的应用
1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
（四）蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
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专题2 细胞工程
（一）植物细胞工程
1.理论基础（原理）：细胞全能性
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞
2.植物组织培养技术
（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→试管苗 ―→植物体
（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
3.植物体细胞杂交技术
（1）过程：
（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程
1. 动物细胞培养
（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）
核移植
胚胎移植
（4）体细胞核移植技术的应用：
①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； ②保护濒危物种，增大存活数量；
③生产珍贵的医用蛋白； ④作为异种移植的供体；
⑤用于组织器官的移植等。
（5）体细胞核移植技术存在的问题：
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
3.动物细胞融合
（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：
比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法
植物体细胞杂交 细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱导原生质体融合 离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导 克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株
动物细胞融合 细胞膜的流动性 使细胞分散后诱导细胞融合 除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体的技术之一
4.单克隆抗体
（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（2）单克隆抗体的制备过程：
（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
（5）单克隆抗体的作用：
① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
专题3 胚胎工程
（一）动物胚胎发育的基本过程
1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
2、动物胚胎发育的基本过程
（1）受精场所是母体的输卵管上段。
（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。
（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。
（4）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。
（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。
（二）胚胎干细胞
1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
3、胚胎干细胞的主要用途是：
①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；
②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；
③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；
④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；
⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。
（三）胚胎工程的应用
1.体外受精和胚胎的早期培养
(1)卵母细胞的采集和培养：
主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。
(2) 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。
(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)
2.胚胎移植
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）
地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(3) 生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
(4) 基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
3.胚胎分割
(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。
(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）
(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
专题4 生物技术的安全性和伦理问题
（一）转基因生物的安全性争论 ：
(1)基因生物与食物安全：
反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变
正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据
(2)转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响
反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”
正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限
(3)转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响
反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体
正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境
（二）生物技术的伦理问题
(1)克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。
否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。
肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。
中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。
(2)试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点，多数人持认可态度。
否定的理由：把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。
肯定的理由：解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。
(3)基因身份证：
否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。
肯定的理由：通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。
（三）生物武器
(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。
(2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。
(3)特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。
(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度
Ⅱ 膀胱发生器
（1）显微注射法是将目的基因导入动物受体细胞最有效的方法．
（2）由于受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达，因此进行基因转移时，通常要将外源基因转入受精卵（或早期胚胎）中．
（3）检测外源基因是否插入了小鼠的基因组通常采用DNA分子杂交技术．
（4）在研制膀胱生物反应器时，应在目的基因前加入膀胱组织特异性表达的启动子，使外源基因在小鼠的膀胱上皮细胞中特异表达．基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等．
故答案为：
（1）显微注射
（2）受精卵（早期胚胎） 受精卵（或早期胚胎）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞中表达
（3）DNA分子杂交
（4）膀胱上皮 生长激素合成基因（目的基因） 终止子 标记基因
Ⅲ 回答下列有关生物技术问题：（1）继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一
（1） ①由于受精卵的全能性最高，所以进行基因转移时通常将外源基因转入受精卵中． ②当外源基因的插入使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达时就会导致受精卵死亡． ③检测外源基因是否插入了小鼠基因组通常采用DNA分子杂交技术． ④制作膀胱生物反应器时，需要在目的基因前加入膀胱细胞中特异性表达的启动子，使外源基因在小鼠膀胱细胞中特异表达．（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌；操作者的双手需要进行清洗和 消毒；由于紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构，因此静止空气中的细菌可用紫外线杀灭．（3）检测培养基是否被污染的方法是：将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生．故答案为：（1） ①受精卵全能性最高;; ②外源基因的插入使受精卵内生命活动必需的某些基因不能正常表达;; ③DNA分子杂交;;;; ④膀胱（2）灭菌;;消毒;;损伤DNA的结构（3）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生
Ⅳ 关于生物反应器的一些问题
你要问什么？
生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，它是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。在酒类、医药生产、有机污染物降解方面有重要应用。
Ⅳ 生物反应器的例子
这有个笼统的介绍看看对你有帮助没？
生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。
在固定化酶广泛应用的基础上，人们发现天然细胞本身就具有多功能的系列化反应系统采用物理或化学方法将细胞固定化，是利用酶或酶系的一条捷径。一个固定化细胞反应器犹如一台“生命活动功能推动机”。固定化细胞技术开始于70年代，其实际应用程度已超过固定化酶。如美国、欧洲、日本均采用固定化菌体柱床工艺大规模生产高果糖浆。
输卵管生物反应器
1993年英国罗斯林研究所Sang博士研究禽类蛋黄表达系统，在鸡蛋的蛋黄里表达了外源蛋白质，由于蛋黄蛋白质是在肝脏细胞表达的蛋白质，而且含量不高；因此，1994年中国科学院微生物研究所、中国转基因动物学会（筹）副秘书长曾（杰）邦哲提出了禽类转基因输卵管生物反应器，在国际上最早开展采用蛋清蛋白质基因侧翼序列表达外源药用蛋白质的研究，1994年11月（Glodegg Plan）和1995年3月及1996年转基因动物通讯、1995年7月上海首届国际生物技术与药物学术研讨暨展览会、1996年11月北京第1届国际暨第3届全国转基因动物学术研讨会（秘书长曾邦哲）、1997年生物技术通报发表，以及1999年在德国创建的系统生物科学与工程网站阐述了输卵管生物反应器（ovict bioreactor）概念、方法与技术研究。1996年创办第1届国际转基因学术研讨会期间，曾邦哲与加拿大、美国、英国、日本有关转基因禽类实验室联系，但国际上当时没有人开展这项课题，随后与美国Avigenics公司和Georgia大学R.Ivarie教授探讨了输卵管生物反应器的合作研究。1998年，美国Avigenics公司独立开展了规模化投资与研究开发输卵管生物反应器，因中国科学家曾邦哲已经去了以色列。2002年后，国际国内掀起了输卵管生物反应器的研究开发热潮，2003年Science发表了Gloden Egg的评述文章。目前，国际上已有十多家前景看好的公司以输卵管生物反应器作为拳头开发产品，约2003年英国罗斯林研究所也创建了公司，并由Sang博士主持研究课题，从禽类蛋黄表达系统转向了输卵管生物反应器。输卵管生物反应器将称为继哺乳动物乳腺生物反应器后最具发展前景的动物生物反应器。
转基因动物生物反应器的基因构建与表达
《国外医学》预防、诊断、治疗用生物制品分册1999年第22卷第5期
关键词： 转基因动物生物反应器 药物 基因构建 表达
摘要 近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。本文着重介绍转基因动物生物反应器的基因构建以及转基因动物组织特异性表达的最新进展。
以合理的费用获取大量在人体内原本稀少的血浆蛋白在不久前还只是幻想。然而，近年来生物学和分子生物学取得的显着进展终于使这种幻想成为现实。其中，将外源DVA用显微技术注入生殖细胞的原核，将重组DVA转入小鼠胚胎细胞和将DVA整合入宿主染色体和种系传递等重要发现，使用转基因（Tg）动物生产药用蛋白成为可能。此外，生物学技术的发展，如对卵细胞的获得、操作以及再植入和重组DNA等技术进步都为转基因动物生物反应器的成功提供了保证。
转基因动物生物反应器生产药用蛋白一般有两种技术路线。第一种是将目的基因在同源组织中表达蛋白质；第二种是将目的基因构建成杂合基因，转入动物胚胎，通过转基因动物的分泌器官收集并提纯药用蛋白。转基因动物分泌的蛋白经过后加工酷如人体天然蛋白的结构，也有完全相似的生物活性。
同源组织中表达蛋白质
目前，在同源组织中表达蛋白质最典型的例子是在动物的红细胞中表达人的血红蛋白。在人的血红蛋白基因编码序列里启动子有2个CACCC盒，而对应的猪的启动子里只有一个，另一个靠近它的是CGCCC盒。Sharma等[1]将猪的β-启动子与人的β编码基因融合，并将人的β-基因座调控区（β-LCR）和α、ε基因与融合基因的β基因连接在一起构成载体，转入猪胚胎细胞，从转基因猪分泌乳汁中得到的重组人血红蛋白含量高达32g/L。
在转基因动物的分泌器官中生产蛋白
转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。在这些表达器官中，通过构建合适的载体，选择适当的启动子和调控序列可产生比正常水平高得多的重组蛋白。不过，生产系统应尽可能与循环系统隔离，以减少表达产物对宿主动物的影响。
乳腺生物反应器
将所需目的基因构建入载体，加上适当的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要药用蛋白。从融合基因转入胚胎细胞到收集蛋白质有一个过程，包括胚胎植入、分娩和转基因动物的生长。转基因动物从出生到第一次泌乳，猪、羊、牛各需12、14、16个月；并且只有雌性动物泌乳且不连续，一般可持续2、6、10个月。牛、羊等大型家畜能对药用蛋白进行正确的后加工，使之具有较高的生物活性，同时产奶量大，易于大规模生产，因而成为乳腺生物反应器理想的动物类型。
抗凝血酶Ⅲ 第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶Ⅲ，将半乳糖β-酪蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达7g/L[2]。目前该蛋白正用于冠状动脉旁路手术患者的二期临床验证。
β-乳球蛋白 在实验过程中人们发现牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达。Hyttinen等[3]将含有5’端2.8kb和3’端1.9kb的牛BLG基因片段构建成载体，转入小鼠胚胎细胞，可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的BLG，此外，还发现CpG位点的甲基化程度与BLG的表达量有关，甲基化少的转基因小鼠乳液中BLG分泌量较大，可达1～2mg/ml，而其他转基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。
红细胞生成素（EPO） 目前国内外均采用CHO细胞表达生产人EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的EPO，可能是一条理想的途径。将EPO dNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射方法得到转基因小鼠乳汗中的EPO含量可达0.5μg/ml[4]。
α1-抗胰蛋白酶 这也是一个利用BLG基因构建的重组蛋白。将BLG5’末端4.0kb序列与人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊的BLG启动子，以pPOLYⅢ-Ⅰ为载体，转入羊的胚胎细胞，可在转基因羊分泌的乳液中得到含量高达60.0mg/ml的重组蛋白α1AT[5]。转基因在两年前进入了临床验证。
因子Ⅸ Schnieke等[6]将羊的BLG基因5’末端和人的因子Ⅸ cDNA 与含有BLG复制单元和3’末端的片段融合，将构建的杂合基因转入羊的胚胎细胞，从分泌的乳汁中得到125μg/ml的重组蛋白。黄淑帧教授等[7]构建了一个含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因调控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺组织特异性表达载体pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全长hF Ⅸ cDNA ，800bp经过改造的内含子1序列和hFⅨ蛋白的信号肽序列。将线形化的表达载体pMC Ⅸm导入羊的受精卵。转基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量约为95ng/ml。在另一实验中，Yull等[8]将BLG5’末端序列，fⅨ编码序列和缺失隐性3’端连接点的f Ⅸ3’末端不翻译区域的一个小片段融合，构成杂合基因，去掉SphI和SmaI位点，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。转入小鼠胚胎细胞，得到的重组蛋白产量达0.06mg/ml。经过进一步研究，发现是转基因动物乳腺中对DNA的错误剪切使分泌量降低，从而增高重组蛋白产率。在乳腺组织中表达有完全活性的因子Ⅸ是比较成功的，尤其是乳腺组织对因子Ⅸ N端附近的一段含12个葡萄糖残基的序列进行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中没有发现γ-羧化作用。
因子Ⅷ 人FⅧcDNA长约7.2kb，是目前为止表达的最长cDNA。将它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中启动子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重组蛋白。在WAP/FⅧcDNA构建的转基因小鼠中rFⅧ表达最低，而在转基因猪中可达1.0～2.7μg/ml[9]。
单克降抗体 Castilla等[10]将编码了重组单克降抗体（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因组的第一个外显子，使rMab 6A.C3的表达可以由WAP基因调控序列来控制，将构建的杂合基因注入小鼠胚胎细胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的单克降抗体，这种转基因表达产物将广泛应用于预防新生儿肠道感染。
C蛋白 同样在WAP基因的第一个外显子位点，Drews等[11]将人C蛋白cDNA插入，转入小鼠胚胎细胞，可得到产量达1.6mg/ml的重组蛋白。而将上述杂合基因转入猪的胚胎细胞，可使猪分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性与人血浆中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依赖于轻链膜结合区域正确的γ-羧化，因此，转基因猪能分泌有活性的C蛋白表明猪的乳腺细胞可对C蛋白前体高速率地进行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。
膀胱生物反应器
膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。此外，该系统可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显着的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
膀胱生物反应器多用Uroplakin启动子启动人生长激素（hGH）的表达，产生 hGH特异性的高丰度RNA，这些RNA与蛋白分泌量高度相关。Uroplakin基因在多种哺乳动物体内有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。
生长激素 Kerr等[12]将pUPII-LacI用质粒的Kpn i进行消化，用T4DNA多聚酶切去3’端，然后用BamHI消化，分离出3.6kb的5’端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反应器特异性表达所需的大部分序列。将此片段与位于无启动子的pOGH质粒纯化SaI和BamHI位点间的hGH结构基因的5’端连接，得到pUPII-hGH质粒，能表达该质粒的组织分布有限。将得到的pUPII- hGH质粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于显微注射，在膀胱上皮细胞中合成hGH，收集转基因动物尿液，从中提取重组蛋白。但在这一途径中转基因动物会因hGH的作用逐渐肥胖，并导致雌性动物不育症。乳腺生物反应器也能表达hGH。用同源重组方法将hGH基因导入210kb的人α-乳球蛋白位置依赖性YAC载体，将重组的YAC dNA显微注入大鼠胚胎，转基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可达0.25～8.9mg/ml[13]。
翻译与修饰
转基因动物分泌的蛋白，特别是糖链成分的结构与人体蛋白有差异。因此研究分泌蛋白的修饰就显得很重要。在乳腺生物反应器中，蛋白质翻译前修饰的主要方式是在多个位点对乳腺中的蛋白前体进行信号肽剪切和对糖链进行修饰。例如，从山羊乳液中得到的长效组织型纤溶酶原激活剂与人体内和相比较，含有少量的异种（外源）低聚糖，同时，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明显减少，关且出现缺少蛋白质C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，从猪乳液中得到的C蛋白中是没有的；从羊乳液中得到的重组α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差异；在山羊乳腺中观察到了重组抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖与特异天冬酰胺的位点特异性聚合等等。研究小鼠乳液中的重组γ-干扰素可对翻译前修饰有更好的理解，γ-干扰素有大量的位点特异性变化，在N端连接位点进行复杂的唾液酸酸化和连接核心岩藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。与从小鼠细胞中取得的蛋白质相比，分泌的重组蛋白没有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc残基。这些蛋白特异性的糖基化类型可与细胞上的受体结合并清除病人体内的重组蛋白，因此可能会影响疗效，最终的结果尚有待验证。
同源组织表达蛋白质的优点是可对表达产物进行调控并校正珠蛋白链的翻译过程，避免无效的翻译前修饰，使产物蛋白尽可能与人体天然蛋白相似，降低人体内的排斥反应，提高药物蛋白疗效。目前，蛋白分离技术飞速发展，大大提高了蛋白质分离的可行性和分离效率。第二种技术路线中目前以乳腺生物反应器较为多见，因为乳汁易得到，且乳汁中的特异蛋白含量较大，对蛋白水解酶的降解作用也比较稳定。乳汁是一种混合物，含3%～6%的总蛋白，3%～5%的脂类，对蛋白提纯技术要求比较高。另一方面，药用蛋白是在动物乳腺中产生。因此只有含转基因型人雌性动物在泌乳期才能生产药用蛋白，可用的动物数目有限，且生产期较短。膀胱生物反应器的优点在于含有转基因型的两性动物都可用，产后收集时间长，提取产物蛋白浓度双乳液中的含量低得多，尽管收集的尿液多且时间长，生产单位数量的药用蛋白在乳腺和膀胱生物反应器中的成本是差不多的
问题与展望
在转基因动物生物反应器的应用中，有些问题尚待解决。比如，由于转基因动物的基因是镶嵌整合型的，因此它的下一代并不都转基因型。但是在绵羊，猪和山羊中观察到只要转基因型从起始个体传给了下一代，这种转基因型就可以稳定地遗传好几代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的转基因动物大大减少。同时，由于对调控表达水平的程序，指导进行精确的组织特异性和发育调控表达的程序，以及调控和编码内含子序列间可能的相互作用的认识尚不充分[14]，容易引起异位点表达；由于现在的技术还不能控制整合的位点，因此存在对内源基因进行插入诱变的可能性，转基因型的表达会受整合的不同位点的影响。这些因素使得在家畜长成前，要用小鼠对新基因构型进行常规试验。
转基因动物生产的药用蛋白可用于预防和治疗疾病，其转运系统及口服用药引起的耐受性等问题都在作进一步研究。以转基因家畜生产珍贵的药用蛋白具有重大的经济价值和社会效益，这项生物技术最终将会得到广泛应用。
Ⅵ 构建膀胱生物反应器时将什么 和什么重组在一起
膀胱生物反应器 将药用蛋白基因与特殊的启动子等调控组件重组在一起。