微生物测定样品凝胶怎么办

A. 生物凝胶色谱法

凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主
凝胶色谱法图示
要用于有 机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶 性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对勿子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
分子筛效益

一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱系统
具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻[1]。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。

B. 微生物DNA提取的原理和方法是什么

细菌染色体DNA的抽提
一、 目的
熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法
二、原理
要进行重组DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要，抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种，这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提；另一种方法则适用于大肠杆菌染色体的制备。
基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事，细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。
另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。
大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌，所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷键，有助于细胞壁破裂，破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌，同时用蛋白酶K 消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质，然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。
此二种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA 浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB 会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。
三、材料
（一）菌株
大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151。
（二）仪器
电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪。
（三）器皿
玻璃离心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶
（四）试剂
（1）LB 完全肉汤培养液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。
（2）BY 培养液：1%蛋白胨 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5
（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA。
（4）20%SDS
（5）饱和酚
（6）氯仿:异戊醇（24:1 V:V）
（7）预冷无水酒精
（8）TE 溶液
（9）RNase溶液
（10）5mol/L 醋酸钾
（11）蛋白酶K 20mg/ml
四、实验步骤
1、取大肠杆菌C600单菌落于5 毫升LB培养液中，37℃振荡培养过液。
2、将上述菌液1%接种量接种于20 毫升LB 培养液中，37℃摇床振荡培养过夜。
3、已培养好的菌液，收集于10毫升的离心管中，在低速离心机上4000r/min离心10分钟，去上清，留沉淀菌体。
4、用5 毫升的SET 溶液悬浮细胞，加入20% SDS 1毫升，37℃下轻摇过夜，使细胞裂解。
5、加入等体积的饱和酚，上下轻轻摇匀，放置5 分钟后，在低速离心机上3500r/min离心10 分钟。
6、取上相，加入1/2 体积的饱和酚，1/2体积的氯仿异:戊醇，上下翻转均匀，3500r/min离心10 分钟。
7、取上相，加入等体积的氯仿:异戊醇，如第6步，离心。
8、取上相于一干净离心管中，另在一个50 毫升的烧杯中加入15毫升预冷无水酒精，把上述的上相液沿着玻棒慢慢倒入酒精中，并温和地搅拌以使DNA 附着于玻棒上。
9、挑起DNA，再放于干净的酒精中洗涤，然后把DNA溶于50 毫升TE 中，待测浓度。
（二）枯草杆菌染色体DNA 的抽提
1、在BY 斜面上划线活化枯草杆菌BR151。
2、挑一环已活化的BR151 菌株于20 毫升的BY培养液中，37℃摇床振荡培养过液。
3、过夜培养物，收集10 毫升于离心管内，在低速离心机上3500r/min离心10 分钟。
4、沉淀菌体加入0.75 毫升溶菌酶液（8 毫克溶菌酶/1毫升SET），振荡器上悬浮细胞，悬浮液移入1.5 毫升离心管，室温30 分钟。
5、在反应液中加入0.15毫升SDS溶液，蛋白酶K 溶液5 微升，37℃水浴10 分钟后转入75℃水浴5 分钟。
6、加入5mol/L 醋酸钾0.3 毫升，上下翻转均匀，置于冰上30 分钟，期间不时摇动。
于台式高速离心机离10000r/min10 分钟。
7、上清液移入另一离心管，弃沉淀。重复第六步。
8、上清液移入5 毫升的离心管内，缓慢加入2倍体积的无水酒精，DNA呈絮状沉淀。用一灭菌牙签，挑起DNA 沉淀，溶于50微升TE中。待检查浓度。
9、若无絮状沉，则把其置-20℃冷冻3 小时（或-70℃冷冻30 分钟），取出离心10 分钟（10000rPm），去上清，晾干，加入50ul TE溶解（取20ul 点样测定）。
（三）染色体DNA 制备样品浓度测定
1、按实验一方法制备琼脂糖凝胶（0.6%）
2、分别取标准浓度的λDNA 0.05ug、0.1ug、0.15ug、0.2ug，加相应的加样缓冲液混合好，点样。
3、取2 微升染色体DNA 样品点样(冷冻离心获取的DNA样品取50 微升点样)，打开电泳仪电泳，待溴酚兰进入凝胶2 厘米后，停止电泳，紫外灯下观察，估计样品DNA浓度。
五、结果讨论与问题
紫外光下观察DNA 样品纯度，计算出制备的DNA总量和浓度。
1、SDS 在抽提DNA 过程有哪几个作用？
2、在本实验中未加入RNase，那么样品中应出现什么情况？

C. 检测微生物前如何去除样品的抑制作用

微生物检测样品的处理方法
1. 化妆品微生物检测样品的处理（摘至GB7918） 样品的采集
1.1应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样时可适当增加样品包装数量。
1.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
1.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
1.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
1.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。
供检样品的制备
2.1 液体样品
2.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10检液。
2.1.2 油性液体样品，取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL 灭菌的吐温80，在40℃～44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在40℃～44℃水浴中预温），在40℃～44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。
2.2 膏、霜、乳剂半固体状样品
5.2.1 亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL 灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。用其上清液作为1:10的检液。
2.2.2 疏水性样品：称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液。
2.3 固体样品

D. 做微生物限度方法验证的时候，样品不溶于Ph7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，如何处理样品可以取上清液

可溶于十四烷酸异丙酯么？取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，淡温度不得超过44度，趁热迅速过滤。若仍无法过滤，在上一个步骤中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。望采纳，谢谢。

E. 琼脂怎么测定凝胶强度

凝胶强度低于1000的都属于石花菜琼脂粉，95度水泡一泡就能融化，凝胶强度高于1000的是江蓠菜琼脂粉，需要开水煮沸才能完全融化。石花菜的弹性好，凝固点低，江蓠菜的硬度好。石花菜的用量大，江蓠菜的用量小，水粉比例400比1就能做出果冻状，42度凝固。你比照这些特性进行比例小试。青岛琼脂制造有限公司回答。

F. 微生物的测定怎么取样和培养基的制定和最后的观察

问题不够清楚哦，你要测定什么，微生物限度，还是已知菌的检测？
我只能举例说明哦，是关于药品的。不明白的你可以Hi我，或追问。
我根据你的问题按步骤来回答。
一、取样
1、供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位）为检验量的3倍量。
2、对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。
3、供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。
4、供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
5、供试品的取样必须在净化条件下无菌操作，严防再污染。（原料药、装量大的药）
6、有剂型检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，除需取自2个以上包装外，还应取4丸、片以上样品）。
7、固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10克。
8、液体制剂检验量为10毫升。
9、膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为30～50cm2 ，化学膜剂及生化药膜剂检验量为 100cm2 。
10、贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，除另有规定外，口服固体制剂不低于3克，液体制剂采用原液者不得少于6毫升，采用供试液者不得少于3毫升，外用药品不得少于5克。
二、培养基的制定
1、一般如果是微生物限度的话，有两种培养基：检测细菌用营养琼脂培养基，检测霉菌及酵母菌用玫瑰红钠琼脂培养基。
2、另外，如果还有致病菌要求的话，通常革兰氏阴性肠道菌用伊红美蓝琼脂培养基（EMB琼脂），沙门氏菌用沙门氏志贺氏菌属琼脂（SS 琼脂），霍乱弧菌用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（TCBS琼脂），等等……
3、最后的观察：通常是计数，如楼上所说的数个数。然后就是菌落形态的观察，主要有大小、颜色、厚度、边缘状态等等。
不过看到你对楼上的追问，我在想，你是不是想问对未知微生物的鉴定，譬如泥土里的微生物种类、空气中的微生物种类等？
那是微生物的分离和鉴定，不叫检测吧。
那样的话一般是用营养琼脂培养基和马丁氏琼脂培养基。

G. 微生物实验中不易溶于水的固体样品怎么处理

如果本身就是不容性物质，而你还是要用这种物质，在液体里，那只有直接配制进去，不溶就不溶，微生物可以经过自身的代谢功能，也是可以利用这些沉淀的。比如碳酸钙，不溶于水，但在乳酸菌发酵过程的培养液中加入它，微生物生产的乳酸可以与与之反应。从而加以利用。
不过，培养是，带沉淀时的培养液，搅拌返混条件要够。

H. 为什么有些产品检测微生物时要进行融化标准依据是什么

进行微生物检测，必须让样品的组分完全释放出来。微生物样品有些是凝胶状，微生物会过藏在胶体内，如果不能融化，细菌培养是得不得正确结果的。

I. 微生物限度检测，不溶于水的样品如何处理可以取上清液做吗

非水溶性供试品
方法1 取供试品5g（或5ml )，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加人45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1 : 20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XII A无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中．必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为l : 10的供试液。