A. 高通量测序中如何判断土壤微生物数量的多少
在陆地生态系统中，在土壤中生活有数量庞大的微生物种群，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物, 以及真核生物如真菌、藻类( 蓝藻除外) 、地衣等。它们与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S 等物质循环的“调节器”[1 ]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2 ]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性[3 ]。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等现代生物学分子生物学技术的迅速发展, 人们对土壤微生物多样性有了更多的了解；高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。
一、对土壤微生物进行研究的方法
1、微生物平板培养法
传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。
这种方法只限于极少量（0.1%-1%）可以培养的微生物类群，无法对绝大多数微生物的分类地位和系统发育关系的深入研究。
2、分子生物学技术结合测序的方法
在过去的20多年里，分子生物学技术，尤其16SrDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌的研究中。20世纪80年代以来, 逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、稳定同位素探针( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200bp ～900bp为佳，超出此范围的片段难以检测[4]，PCR 扩增所需G/C 碱基对含量至少达40 % ，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到[5]。TGGE 仪器所允许的温度范围为15 ℃～80 ℃，较大片段DNA 的Tm 值因为接近80 ℃而使检测难度提高；若电泳条件不适宜，不能完全保证将有序列差异的DNA片段分开，从而出现序列不同的DNA 迁移在同一位置的现象。
3、高通量测序方法
近年来，16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600碱基的序列，足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[8]，因此454高通量测序的方法因其读长（400~500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogenetic analysis)。
高通量测序的优越性体现在：测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域； 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物；实验操作简单、结果稳定，可重复性强；无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验周期短；测序数据便于进行生物信息分析。
该方法得到顶级期刊的认可（Nature等），已成为土壤微生物多样性检测的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，为客户提供的土壤样本进行高通量测序并进行生物信息学分析。高通量测序因其数据量大，操作过程简单，尽可能避免了繁琐的实验操作过程所造成的样本损失，能够相对客观的反应出土壤样本的真实情况。
二、高通量测序在土壤微生物研究中的应用
1、 研究土壤微生物的物种多样性
微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性，或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成不同的功能群(function group)，通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的产甲烷细菌、固氮菌、根瘤菌等的多样性进行研究。以下是几篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454测序法对西半球的一个大的横断面的4类土壤进行检测和统计学评价。结果表明，这4种土壤中，最丰富的微生物类群拟杆菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而检测结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少，仅为该位点所有序列的0.009%，而农业土壤的比例则为4% -12%。
土壤中细菌的多样性差距非常大，因土壤结构的不同土壤中的细菌群体也呈现出多样化。Triplett等[10]基于焦磷酸测序法来对16S rRNA的V2-V3区域进行测序，估测9个草地土壤中的菌群的整体和垂直特性。对所有752,838条数据序列进行聚类分析，探索菌群在丰度、多样性和组成成分等方面的特异性。作者发现在不同的土壤层中，细菌系统发生的种群或者亚群的不同分配是与土壤的性质有关的，包括有机碳含量、总含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多样性
土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等, 通过分析测定土壤中的一些转化过程, 如有机碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等来了解土壤微生物功能。
氨氧化反应是硝化作用的第一步，也是全球氮循环中由微生物活动形成硝化盐的重要进程。Leininger[11]检测了3个气候区域12块原始和农业用地的土壤里编码氨单加氧酶(amoA)的一个亚基的基因丰度。采用反向转录定量PCR研究及无需克隆的焦磷酸测序技术对互补DNA测序，证实古细菌的氨氧化活性要远高于细菌，证实Crenarchaeota可能是土壤生态系统中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的环境转录组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信息。结果认为，通过该方法可以同时研究微生物生种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。群落基因组学分析可以通过研究微生物基因组序列与某些表达特征之间的关系，获得一些微生物功能方面的信息。但同时也需要运用其他方法将特定功能与具有这种特定功能的微生物群落结构对应起来。对rRNA表达基因和与环境因素相关的主要酶类的基因进行定量化和比较分析，将能了解微生物结构与特定功能之间的关系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是参与到氮流失和温室气体排放等氮循环过程的重要流程之一。通过宏基因组测序的方法，结合分子检测和焦磷酸测序，Ryan等分离鉴定了操纵编码反硝化过程的酶类。通过筛选77,000个土壤宏基因组文库中得到的克隆，最终分离并鉴定了9个参与反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。Zachary等[14]以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。通过液相色谱/质谱（LC-MS），作者确定H218O中的氧原子结合到了所有的DNA结构成分中。尽管这种结合不是均匀的，还是可以明显的将标记了18O和未标记的DNA区分开来。作者发现DNA和细胞外的H2O中的氧原子在体外没有发生交换，表明掺入DNA的18O是相对稳定的，并且掺入到细菌DNA中的18O的比例较高（48-72h）。土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究和生态类群的划分。
B. 土壤微生物有哪些
土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，严格意义上应包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有几亿到几百亿个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。
土壤微生物一般以细菌数量最多，有益的细菌有固氮菌、硝化细菌和腐生细菌；有害的细菌有反硝化细菌等。施用有机肥有益于微生物的生长和繁殖。
土壤微生物功能多样性：指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，主要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种的现状进行研究。主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。
土壤微生物的功能多样性：指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义如：分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等。一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性。
土壤微生物结构多样性：指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因。
土壤微生物的遗传多样性：是土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映。
土壤微生物是土壤中物质转化的动力：如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分解和合成，土壤酶与微生物细胞一起推动物质转化。全球变暖、森林锐减、土壤退化都与微生物有关。
C. 地上植物的多样性会影响土壤微生物的多样性吗
地上植物的多样性会影响土壤微生物的多样性
生物多样性通常包含三层含义，即生物种类的多样性、基因（遗传）的多样性和生态系统的多样性．生物种类的多样性是指一定区域内生物钟类（包括动物、植物、微生物）的丰富性，如我国已知鸟类就有1244种之多，被子植物有3000种，即物种水平的生物多样性及其变化．基因（遗传）的多样性是指物种的种内个体或种群间的基因变化，不同物种（兔和小麦）之间基因组成差别很大，同种生物如兔之间（有白的、黑的、灰的等）基因也有差别，每个物种都是一个独特的基因库．基因的多样性决定了生物种类的多样性；生物种类的多样性组成了不同的生态系统；生态系统的多样性是指生物群落及其生态过程的多样性，以及生态系统的环境差异、生态过程变化的多样性等．
D. 寿光大棚蔬菜基地生物多样性
一、土壤动物多样性
寿光市大棚蔬菜基地不同样地大型土壤动物类群组成统计结果见表5-13。从中可以看出：大型土壤动物中蚯蚓等耐污性强的类群占相对优势，间或夹杂有蝼蛄、步甲和金龟子等常见农田昆虫，而蜘蛛、马陆等不耐污种类也占有有相当比重。这一方面体现了当地农田土壤动物区系的特点，同时也反映出寿光市重金属污染较鱼台等地轻微。
该区不同样地土壤动物不同类群及数量统计结果见表5-14。从中可以看出：土壤动物中原生动物密度最大，线虫次之，旱生动物数量也不少，土壤线虫与旱生动物密度之比平均为12∶1。旱生动物中蜱螨目和弹尾目是优势类群，这些都符合农田土壤动物区系的一般规律。旱生土壤动物丰度高于鱼台县，显示出该地区重金属污染程度较低。
研究区土壤动物各类群数量与土壤重金属元素含量的相关性分析统计结果见表5-15。从中可以看出：土壤原生动物数量与各种元素均未显示明显相关关系。土壤线虫数量与Cd含量呈显着正相关（r＝0.517，P＜0.05），而与其他元素均未显示明显相关关系。旱生土壤动物数量与Cr含量呈显着正相关（r＝0.719，P＜0.01），而与其他元素未显示明显相关关系。
以上结果显示动物数量与某些重金属元素含量成正相关，这主要是由于该地区重金属污染程度较轻，还没有达到影响土壤动物数量的程度。可能是由于其他外在因素对土壤动物数量影响更大，从而形成了干扰。
寿光大棚蔬菜基地两个深层土壤剖面样品中土壤动物数量统计结果见表4。从中可以看出土壤动物数量随着深度增加而急剧降低，这可能是由于土壤有机质含量降低所致，也可能是土壤孔隙的含氧量降低所致。
表5-13 寿光大棚蔬菜基地不同样地大型土壤动物区系组成表
表5-14 寿光大棚蔬菜基地不同样地土壤动物类群数量表
表5-15 寿光大棚蔬菜基地土壤动物各类群数量与土壤重金属元素含量的相关性表
注：*为P＜0.05，**为P＜0.01。
寿光大棚蔬菜基地深层土壤动物数量与土壤重金属元素含量相关性分析结果见表5-16。结果显示：寿光剖面17 土壤原生动物数量与 Cd 含量呈明显正相关（r ＝0.965，P ＜0.01），与Cu含量呈明显正相关（r＝0.974，P＜0.01），与Mn含量呈明显正相关（r＝0.903，P＜0.05），与Mo含量呈明显正相关（r＝0.973，P＜0.01），与Zn含量呈明显正相关（r＝0.976，P ＜0.01）；寿光剖面18 土壤原生动物数量与Cu 含量呈明显正相关（r＝0.884，P＜0.05），与Mo含量呈明显正相关（r＝0.902，P＜0.05）。这可能是由于重金属元素含量较低，还没有达到影响土壤动物数量的程度。
表5-16 寿光大棚蔬菜基地深层土壤剖面原生动物和线虫数量表
二、不同生理类群土壤微生物多样性
表5-18显示了寿光大棚蔬菜基地表层土壤中不同生理类群微生物总数。选取其中的代表性数据进行分析。其中样品 SGP001、SGP011、SGP021 取自大棚内的土壤，而SGP006、SGP016、SGP026来自大棚外的土壤，SGP001、SGP006所处的土壤类型为潮土，而SGP011、SGP016、SGP021、SGP026所处的土壤类型为石灰性褐土。同时6 个样品所处土壤上栽种的农产品依次为：大棚黄瓜、玉米、大棚茄子、玉米、绿豆和番薯、玉米，这几种农作物的生长状况依次为刚出土→成熟→幼苗→成熟→成熟→成熟。除栽种的作物外，还存在各种优势野草和伴生野草。从实验数据观察，土壤样品中的优势菌主要是细菌、放线菌、固氮菌、氨化菌。总的来看，无论是微生物总量还是各类微生物的量，大棚内土壤样品中微生物的数量明显高于大棚外土壤的。
表5-17 寿光大棚蔬菜基地深层土壤剖面原生动物和线虫数量与土壤重金属元素含量相关性表
注：*为P＜0.05，**为P＜0.01。
表5-18 寿光大棚蔬菜基地表层土壤中不同生理类群微生物总数表（×10 5 number g -1 soil dw）
在6个样品中，细菌的数量都极大地高于其他菌的数量，这说明了不同作物根际细菌占绝对优势。除细菌之外，栽种茄子的土壤中真菌量较其余5个样品中的量大幅度增加，而在栽种黄瓜的土壤中，放线菌、固氮菌的量明显高于其他的样品的，李文庆等的研究发现寿光蔬菜产区，黄瓜、架豆、苦瓜能够增加土壤细菌数量，西葫芦、豆角、茄子引起土壤细菌降低，黄瓜、辣椒表现抑制土壤真菌作用，黄瓜、西红柿能够促进放线菌数量的增长，茄子、豆角、西葫芦不利于土壤放线菌的生长。这也与我们的研究结果相符。在栽种绿豆和番薯的土壤中的样品中，氨化菌的数量较其他的增加。在栽种玉米的土壤中的样品中，除反硝化菌、真菌之外，石灰性褐土的土壤样品中各类菌的数量都高于潮土的土壤样品中各类菌的数量，同时纤维分解菌数量增加也较明显。
土壤中有丰富的化学元素，它参与了微生物的各种生命活动中，化学元素的量也间接影响了微生物的生物量。本实验根据各微生物类群的数量和相应土样中的化学元素量计算出土壤中的主要元素与8类微生物量的相关性，结果见表5-19。
表5-19 寿光大棚蔬菜基地主要化学元素与微生物的相关性比较表
注：*为P＜0.05。
从实验数据得出除个别情况，化学元素都极大地影响着微生物的数量，同一种化学元素与8大类微生物的相关性数据差别不大，而不同元素对同一微生物的影响却有明显的差异，这反映了不同元素参与的生命活动不同。同时Ni、Hg、Pb等重金属在含量较低时对微生物影响极小，反映了微生物对其的需求极少，而P、N、S、Zn与微生物的相关性高可能由于它们参与生命必须物质的合成，生物需求量极高。
由表5-20看出，大棚内每一深度的样品中各类微生物的数量总是大于其相应点的大棚外土壤样品中的，优势菌主要是细菌、放线菌、氨化菌，其中细菌占绝对优势。忽略个别数据，无论大棚内外微生物数量总的趋势是随土层加深而减少，但到达一定深度实会出现数量的增加，表现出上层多于下层的垂直分布特点。表层土壤中微生物分布最多，占三层微生物总数的80%多，亚表层土壤微生物占微生物总数的10%左右，底层土壤微生物极少。各类群微生物在表层的分布情况为细菌、放线菌、真菌、纤维素分解菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌、反硝化菌分别约占 77.88%、65.67%、71.42%、44%、33.05%、55.93%、22.22%、67.07%。说明真菌、细菌、放线菌、反硝化菌绝大多数为好气的，主要分布在表层，与之相比，纤维素分解菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌相对分布在土壤较深层次。但宏观地说，微生物数量及生物活性最大的区域是表层土壤。其中细菌数量最多，垂直递减陡度较大，各类菌都有中途数量回升的现象，这可能与厌氧菌数量的增加有关。
表5-20 寿光大棚蔬菜基地深层土壤微生物总数表（×10 -6 number g -1 soil dw）
三、土壤微生物功能多样性
表5-21显示了寿光大棚蔬菜基地土壤微生物 BIOLOG 多样性指数。SGP081、SGP076、SGP101、SGP091、SGP051、SGP086、SGP066、SGP061 75 h 可利用的单一碳源底物较少，各种多样性指数较低，平均光吸收值（AWCD）较少，而SGP046、SGP041、SGP036、SGP026、SGP001、SGP056、SGP011 可利用的单一碳源底物较多，各种多样性指数较高，平均光吸收值（AWCD）较大。
表5-22说明 SGP081、SGP076、SGP101、SGP091、SGP051、SGP086、SGP066、SGP061与SGP046、SGP041、SGP036、SGP026、SGP001、SGP056、SGP011的Shannon指数存在显着差异性。前者Shannon指数明显小于后者，说明前者多样性明显低于后者。
表5-21 寿光大棚蔬菜基地土壤微生物BIOLOG 多样性指数表
表5-22 寿光大棚蔬菜基地Shannon 指数差异性比较表
续表
表5-23可看出S值，H′、U、G与As、Co、Ni、Pb、N、MgO、K2 O存在显着相关性，U 与B 存在显着相关性，S E 与As，Ni 存在显着相关性，M E 与Ni 存在显着相关性，AWCD与As、B、Co、Ni、Pb、MgO、K2 O存在显着相关性。
表5-23 寿光大棚蔬菜基地土壤微生物BIOLOG 多样性指数与地球化学元素的相关性表
续表
注：*为P＜0.05。
寿光深层土壤微生物S、H′、U、AWCD 值随着深度的增加而减少，G、S E 值总的来说随着深度的增加而增加，M E 随深度的变化规律不明显（表5-24）。
表5-24 寿光大棚蔬菜基地深层土壤微生物BIOLOG 多样性指数表
四、土壤微生物结构多样性
寿光大棚蔬菜基地表层土壤微生物群落结构多样性分析结果见表5-25。SGP 066、SGP 041的细菌总量明显高于其他样地，而SGP 076、SGP 051、SGP 081、SGP 101细菌总量较低。SGP056真菌含量明显高于其他样地，SGP076、SGP081、SGP096真菌含量较低。寿光市所有样地中土壤GP含量少于GN。除了SGP046、SGP056其余样地中就细菌与真菌而言细菌含量占优势。
由表5-26可看出SGP071、SGP 076、SGP 051、SGP 081、SGP 101与SGP 066、SGP 041、SGP 031、SGP 056存在显着差异性。前者土壤表层细菌含量明显少于后者。
表5-27显示了寿光大棚蔬菜基地表层土壤微生物结构多样性与地球化学元素的相关性。在P＜0.05范围内，GP和真菌与Co、Ni、V存在显着负相关，与K2 O存在显着正相关。细菌总数与Co、Ni显着负相关，与K2 O存在显着正相关。GP/GN与Co、Ni、V存在显着负相关，Bacteria/Fungi 与As、Pb 呈显着负相关，与 Co、Cr、Ni、V 呈显着正相关。
表5-25 寿光大棚蔬菜基地表层土壤微生物群落结构表
表5-26 寿光大棚蔬菜基地表层土壤微生物细菌含量差异性比较表
表5-27 寿光大棚蔬菜基地表层土壤微生物结构多样性与地球化学元素的相关性表
续表
注：*为P＜0.05。
表5-28给出了寿光大棚蔬菜基地深层土壤微生物群落结构。寿光市大棚蔬菜基地深层代表GN、GP、Fungi的FAME的含量总的来说随着深度的增加而降低，但SGP01708数值偏大。
表5-28 寿光大棚蔬菜基地深层土壤微生物群落结构表
五、土壤种子库群落结构多样性
寿光大棚蔬菜基地土壤种子库中共计7科11属12种植物，其中禾本科5种，十字花科2种，占总数的58.3%；其余科各1种。其中，一年生草本植物10种，多年生草本植物2种，分别占总数的83.3%、16.7%，无半灌木。
该区土壤种子库密度为483.4 ± 129.5 粒/m2，其中，以酢浆草（Oxalis corniculata）的密度最高。寿光蔬菜产区主要以大棚生产为主，人为降低了土壤杂草种子库的输入，且耕作频繁，人工干扰大，种子库输出频繁，是种子库密度明显低于济南、鱼台的重要原因。
各样地的多样性指数如表5-29所示。寿光大棚蔬菜基地的种子库Margalef丰富度指数、辛普森多样性指数、香农-威纳指数和 Peilou 均匀性系数分别为1.966、0.796、1.80、0.72。
表5-29 寿光大棚蔬菜基地各样地种子库密度和多样性指数表
注：R为Margalef丰富度指数；D为辛普森多样性指数；H′为香农-威纳指数；E为Peilou均匀性系数。
E. 微生物的多样性包括哪些方面
微生物在地球上几乎无处不有，无孔不入，人的皮肤上，口腔，肠道里都有许多微生物。微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各种微生物生长繁殖的大本营，约占微生物总量的70-90%，任意取一把土或一粒土，就是一个微生物世界，不论数量或种类均最多。在肥沃的土壤中，每克土含有20亿个微生物，即使是贫瘠的土壤，每克土中也含有3－5亿个微生物。空气里悬浮着无数细小的尘埃和水滴，它们是微生物在空气中的藏身之地。哪里尘埃多，哪里的微生物就多。
迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，目前已知的种类只占地球上实际存在的微生物总数的20%，人类生产和生活中仅开发利用了已发现微生物种数的1%。
微生物种类繁多，人们研究得最多、也较深入的主要有细菌、放线菌、蓝细菌、枝原体、立克次氏体、古菌、真菌、显微藻类、原生动物、病毒、类病毒和朊病毒等。
细菌是一类细胞细而短、结构简单、细胞壁坚韧，以二等分裂方式繁殖的原核微生物，分布广泛。观察细菌常用光学显微镜，其大小用测微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm)为单位。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而有差异。细菌按其外形，主要有球菌，杆菌，螺形菌
某些细菌到一定的发育阶段或当环境条件不适于细菌繁殖时，会在细胞内形成一个圆形或椭圆形的，对不良环境条件具有高度抵抗力的休眠体，叫做芽孢；芽孢的形成能力是由这种菌的遗传特性所决定的；细菌中球菌不会产生芽孢；产生芽胞的都是革兰阳性菌。
放线菌的形态、大小和结构
放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。
根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群。
霉菌的菌丝构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。
菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为3-10微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。
提起酵母菌这个名称，也许有人不太熟悉，但实际上人们几乎天天都在享受着酵母菌的好处。因为我们每天吃的面包和馒头就是有酵母菌的参与制成的；我们喝的啤酒，也离不开酵母菌的贡献，酵母菌是人类实践中应用比较早的一类微生物，我国古代劳动人民就利用酵母菌酿酒；酵母菌的细胞里含有丰富的蛋白质和维生素，所以也可以做成高级营养品添加到食品中，或用作饲养动物的高级饲料。
酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长，例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果园土壤中最为常见。
病毒的形态基本可归纳为三种：杆状、球状和这两种形态结合的复合型。没有细胞构造，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质，在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖。病毒粒子通常形成螺旋对称、二十面体对称和复合对称。
病毒粒子是无法用光学显微镜观察的亚显微颗粒，但当他们大量聚集在一起并使宿主细胞发生病变时，就可以用光学显微镜加以观察。例如动、植物细胞中的病毒包涵体；有的还可用肉眼看到，如噬菌体的噬菌斑等。
F. 为什么土壤微生物有多样性
环境的复杂性导致了生物的多样性。不同生物运用不同策略适应复杂环境导致了生物的多样性。微生物亦是如此。
G. 如何运用克隆文库法分析土壤真菌微生物多样性
如何运用克隆文库法分析土壤真菌微生物多样性
按照我理解的“土壤中微生物的种类”是指古菌、细菌、真菌等生命体而不包括藻类、原生动物等低等动植物.
土壤中微生物的种类数量的调查属于微生态区系分析的范畴.
一般说来,我们所开展的研究工作主要采用以下两类方法进行研究分析：
1、经典的选择培养法：
即采用选择培养的方法,对土壤样品中的细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等几大类微生物进行分类培养,还可以采用详细的选择培养方式比如无氮培养基培养固氮微生物、利用MPN法测定氮循环微生物等等,从功能角度再细分一下微生物的种类组成；还可以通过寡营养、富营养、长周期培养等方法做进一步详细的分析.
此类方法工作量大,分析精度和全面性都有一定的局限性.但同时是任何层面的研究都不可以忽略的方式方法,是获得微生物菌种资源纯培养以进行深入研究的唯一方法.
2、分子微生态学方法
是基于DNA分析和测序基础上的分子微生态学研究方法,常用的有DGGE（变性梯度凝胶电泳）、克隆文库构建、T-RFLP以及宏基因组技术,对样品中的DNA进行电泳乃至测序分析,从分子水平确定样品中微生物的种类和数量.
从全面性和深度以及工作效率方面都教常规方法有大幅度提升,但目前仍然有不成熟的地方.另外其成本远高于常规方法.
H. 土壤生物多样性与土壤地球化学环境质量之间的关系
土壤由气相、液相和固相三相合一的、生物赖以生存的重要载体，又是具有物理、化学性质及生命形式的复合体。土壤生物学家常把土壤看作是地下栖居生物的一个巨大的、变动的培养基地，并且是将高等植物所不能利用的物质通过土壤生物作用变成可以利用的一个场地。土壤有其本身的结构和肥力特点。土壤圈在地球化学循环中发挥着重要的功能作用，推动着土壤圈内部矿质营养元素的循环转化，并能具有促进植物体生长的肥力效应而显示出强大的生产力。占土壤组成极少部分的生物体，在土壤发挥其巨大功能的过程中起着关键不可替代的作用，即土壤生物是整个土壤圈的核心，它在促进有机质分解、土壤矿质营养循环、维持及提高土壤肥力方面发挥着关键作用，因而也对大气圈、水圈产生着重大影响。因此，有必要研究土壤生物群落结构及其功能作用，特别是在传统的化学农业因其带来的环境负面效应而受到严峻挑战的当今，人类在面临既要提高或维持农业产量又要减少或防治环境污染的双重压力、应如何做出抉择的形势下显得尤为突出。
土壤生物的组成，可分为土壤微生物和土壤动物两大类群，一般包括微生物类群的细菌、真菌和放线菌，原生动物类群的鞭毛虫、纤毛虫和肉足虫，微型节肢动物如土壤螨类和弹尾目昆虫，以及线虫、线蚓和蚯蚓等。梁文举等（2001）及Hendix等（1990）对土壤生物区系在土壤生态系统过程中包括在养分循环和土壤结构中所起的重要作用作了评述。在陆地生态系统中，土壤生物区系是分解者食物网的重要组成部分，是分解作用、养分矿化作用生态过程的主要调节者（Wardle，1995）。尽管在大多数系统中微生物群落约占C和N矿化和固定量的90%，但其活动受着土壤动物的调节。土壤动物通过取食细菌和真菌及将微生物繁殖体向新的位点运输直接调节微生物的活动。土壤动物消耗微生物生物量后，排泄出无机N，然后这些无机N素又进一步供给微生物或被植物吸收利用。土壤动物通过破碎有机质和形成粪粒来增加微生物侵袭的表面积，通过粪土的产生间接地改变微生物的微环境，转过来又影响土壤孔隙度、团聚体大小和稳定性。一般来说，土壤动物活动对生态系统过程产生最终的影响是提高有机质的分解速率和养分周转量。根圈（或称根际）通常是指受作物根系活动影响，在物理、化学和生物学特性上与周围土壤有别的土壤微区，是土壤根系生物群落相互作用的系统，也是养分、水分和其他物质进入根表面的门户，因而普遍受到重视。胡锋等（1998）通过盆栽试验对比研究了两种基因型小麦根际土壤动物和微生物的数量动态及根际效应，认为根际土壤动物与微生物之间相互作用机制在于食微动物与微生物形成的捕食者-猎物间的食物链关系。根际中丰富的分泌物促进了微生物的增殖。这些在食物链中处于最低营养级的微生物作为资源生物即土壤动物的食物，支持了较高的根际动物种群，而较高营养级的动物又可通过捕食、竞争作用影响微生物或其他土壤动物的数量乃至种群结构。
土壤种子库的研究是生物多样性研究中的一部分，长命种子具有重要的遗传学意义，种子库被认为是植物种群基因多样性的潜在提供者（Harper，1977），所以土壤种子库在维持种群和群落的生态多样性和遗传多样性方面具有重要意义。其次，从实践来说，在生长季刚开始的时候，了解种子库的组成和多度可以帮助我们预测农田、牧场和自然植物群落的生产量及承载量（Russi et al.，1992）
本次对济南重金属污染区（简称济南）、鱼台优质稻生产基地（简称鱼台）、寿光大棚蔬菜基地（简称寿光）各生物学参数的差异性进行比较，采用统计学方法进行了土壤生物学参数间及土壤生物学参数与土壤地球化学元素间的相关性分析，评价三地土壤的质量。
一、土壤生物多样性变化特征
济南、鱼台、寿光三地土壤生物多样性分布特征和变化规律各有其特点。3个地区土壤中线虫数量显着低于原生动物数量，原生动物数量又显着低于细菌数量，这与其在食物链中的位置和取食关系是一致的。寿光的线虫、真菌、放线菌、固氮菌和反硝化菌数量显着高于济南、鱼台的线虫、真菌、放线菌、固氮菌和反硝化菌数量，鱼台地区高于济南地区，但未表现出显着差异。3 个地区的原生动物、细菌、氨化菌和硝化菌数量无显着差异，表明这几个生物类群对重金属污染的敏感程度较低。纤维素分解菌的数量为鱼台＜济南＜寿光，说明纤维素分解菌除受到重金属污染外还受到其他因素比如植物枯落物种类、数量等的影响。
代表微生物新陈代谢能力和多样性的各多样性指数与种群数量的分布规律存在差异（表5-46）。3个地区的Shannon丰富度不存在显着性差异。Shannon多样性指数济南低于鱼台寿光，McIntosh多样性指数鱼台和寿光低于济南，Shannon均匀度和McIntosh均匀度济南低于鱼台和寿光。
表5-46 济南、鱼台、寿光三地的土壤生物参数的方差分析表
代表不均匀程度的Gini指数济南高于鱼台和寿光。代表新陈代谢能力的AWCD值济南低于鱼台和寿光。总体来说济南地区微生物的新陈代谢能力和均匀性低于鱼台和寿光。3个地区土壤微生物结构间存在差异，济南地区革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例和细菌/真菌比例显着高于其他两地。3个地区的土壤种子库各参数间不存在显着差异，说明重金属污染对土壤种子库影响不大。3个调查地区各分析指标的变异系数差异较大，总体来说，微生物活性的变异系数低于微生物数量的变异系数，线虫数量的变异系数低于原生动物的变异系数，地球化学元素的变异系数低于生物的变异系数。
二、土壤生物多样性指标之间的相关关系
由表5-47可以看出，土壤细菌与放线菌、固氮菌、氨化菌、硝化菌和反硝化菌之间存在显着的正相关关系。土壤真菌与放线菌、固氮菌，放线菌与细菌、真菌、固氮菌和反硝化菌，固氮菌与细菌、真菌、放线菌、反硝化菌，氨化菌与细菌、硝化菌和反硝化菌，硝化菌与细菌、氨化菌和反硝化菌，反硝化菌与细菌、放线菌、固氮菌、氨化菌和硝化菌之间存在显着的正相关关系。这是合乎常理的，因为各微生物类群的适宜生活的条件虽然各有差异，但是总体是营养丰富的、肥沃的土壤适宜于绝大多数类群微生物的生长，而且微生物各分类群和功能群间也有交叉。
土壤线虫与Biolog Shannon丰富度、McIntosh指数之间存在显着负相关关系，与Shannon均匀度、McIntosh均匀度之间存在显着正相关关系，而土壤微生物各生理类群与Biolog各多样性指数间不存在显着的正相关关系，说明土壤线虫作为食微生物的动物会显着降低微生物利用底物的多样性，但通过这种捕食关系的调节，微生物的均匀度增加，线虫在维持食物链的动态平衡中具有非常重要的作用。
三、土壤生物多样性与土壤地球化学环境之间的关系
由表5-48可以看出土壤生物各参数与各地球化学元素间存在着不同的相关性。土壤线虫与Ni之间存在着显着的正相关关系，与Pb、Se之间存在着显着的负相关关系。土壤原生动物与Cr、S之间存在着显着的正相关关系。土壤真菌与K2 O，土壤放线菌、固氮菌、纤维素分解菌与N，土壤硝化菌与F之间存在着显着的正相关关系。Biolog Shannon均匀度与Ni之间存在着显着的正相关关系。Biolog McIntosh指数与Co、F、Mn、Ni、V、Al2 O3、Fe2 O3、MgO、K2 O之间存在着显着的负相关关系，与Se、Na2 O之间存在着显着的正相关关系。Biolog McIntosh均匀度与Ni之间存在显着的正相关关系。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌PLFA含量都与B存在显着的正相关关系。真菌PLFA含量与As、B、Mn、V、Al2 O3、Fe2 O3、MgO、CaO、K2 O存在显着正相关关系，与SiO2、Na2 O存在显着负相关关系。革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例与Cr、Hg、Mo、Zn、Se、S、K2 O存在显着正相关关系。细菌/真菌存在显着负相关关系。土壤种子库各参数与地球化学元素间不存在显着正相关关系。这说明各地球化学元素对各土壤生物的作用不同，通过不同的生物学指标可用于指示某种、某几种重金属或重金属复合污染的情况。
四、土壤重金属污染程度的生物学指标
寿光的线虫、真菌、放线菌、固氮菌和反硝化菌数量显着高于济南、鱼台数量，鱼台地区高于济南地区，但未表现出显着差异。Biolog Shannon均匀度、Biolog McIntosh均匀度济南低于鱼台、寿光，代表不均匀程度的Gini指数济南高于鱼台、寿光，AWCD值济南低于鱼台、寿光。济南地区革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例和细菌/真菌比例显着高于其他两地。说明以上指标可作为重金属复合污染的生物学指标。线虫、真菌、放线菌、固氮菌、反硝化菌数量、Biolog Shannon均匀度、Biolog McIntosh均匀度越低表明重金属复合污染越严重，Gini指数越高表明重金属复合污染越严重。
由表5-48我们可以找到重金属污染的生物学指标。土壤线虫、Biolog Shannon均匀度、Biolog McIntosh指数可作为Ni污染的生物学指标，土壤线虫越多、Biolog Shannon均匀度越高表明Ni含量越高，Biolog McIntosh指数越低表明Ni污染越严重。土壤线虫还可以作为Pb污染的生物学指标，土壤线虫越少表明Pb污染越严重。土壤原生动物、革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例可作为Cr污染的生物学指标，土壤原生动物、革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例越高表明Cr污染越严重。Biolog McIntosh指数可作为Co污染的生物学指标，Biolog McIntosh指数越低暗示Co污染越严重。Biolog McIntosh指数和真菌PLFA含量都可以作为Mn、V污染的生物学指标，Biolog McIntosh指数越低、真菌PLFA含量越高暗示Mn、V污染越严重。真菌PLFA含量还可作为As污染的生物学指标，真菌PLFA含量越高暗示As污染越重。革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例还可作为Hg、Zn污染的生物学指标，其比例越高，表明Hg、Zn污染越严重。
总的来说，济南地区土壤生物的数量和活性低于鱼台寿光。细致的分，不同的生物学参数可作为不同重金属污染的生物学指标。土壤动物尤其是土壤线虫群落多样性已用作土壤质量以及土壤生态演替过程的生物指标（李文芳等，2005；Liang，et al.1999）。研究发现土壤线虫作为敏感生物可作为 Ni、Pb 的生物学指标。澳大利亚学者 Pankhurst 等（1995）把细菌、真菌、放线菌数量作为土壤质量的生物指标。同时研究者也发现土壤受污染程度越低、土壤质量越高，真菌、放线菌数量越高。此外，其他生物学指标如革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例、真菌PLFA含量、Biolog多样性指数等也可作为重金属污染的生物学指标。总之，用土壤生物作为敏感、快速的重金属污染生物毒性的指示物，具有广阔的应用前景。
通过济南、鱼台及寿光三地的生物多样性研究表明，济南、鱼台、寿光土壤生物多样性分布特征和变化规律各有其特点。总体来说寿光的线虫、真菌、放线菌、固氮菌、反硝化菌数量显着高于济南、鱼台，鱼台地区高于济南地区，但未表现出显着差异。3个地区的原生动物、细菌、氨化菌、硝化菌数量无显着差异。济南地区微生物的新陈代谢能力和均匀性低于鱼台、寿光。3个地区土壤微生物结构间存在差异，济南地区革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比例和细菌/真菌比例显着高于其他两地。3个地区的土壤种子库各参数间不存在显着差异。
生物多样性特征符合农田重金属污染地区的生态系统的一般规律，结果说明寿光市重金属污染较鱼台等地轻微，重金属元素对土壤动物类群和数量以及微生物等具有不利影响。
表5-47 济南、鱼台、寿光三地土壤生物多样性指标之间相关系数矩阵表
续表
注：*为P＜0.05。
表5-48 济南、鱼台、寿光三地土壤生物多样性指标与土壤地球化学元素相关分析表
续表
I. 什么是微生物多样性它的表现方式有哪些
生物多样性biodiversity是指一定范围内多种多样活的有机体(动物、植物、微生物) 有规律地结合所构成稳定的生态综合体。 这种多样包括动物、植物、微生物的物种多样性，物种的遗传与变异的多样性及生态系统的多样性。其中，物种的多样性是生物多样性的关键，它既体现了生物之间及环境之间的复杂关系，又体现了生物资源的丰富性。微生物多样性是指微生物的生命形式的多样性，包括生理代谢类型、代谢产物、遗传基因及生态类型的多样性。
J. 问答题（20分）：微生物的多样性表现在哪些方面请加以简要论述。
1.营养类型的多样性
动物自身不能从简单的无机物制造有机物，也不能从日光中获得能量，必须直接或间接地以绿色植物为食，来获取现成的有机物以获得生命活动所需的能量。由此动物只能是化能异养性生物。绝大多数植物只从外界吸收简单的无机物（从空气中吸收二氧化碳，从土壤中吸收水和无机盐），还吸收日光作为能源，通过光合作用在体内制造有机物提供本身代谢活动所需的有机物和能量。由此绝大多数的植物为光能自养型生物。微生物的营养类型之多是动植物所大大不及的。有以二氧化碳为碳源，光为能源的光能自养型微生物如：蓝细菌，紫硫细菌，绿硫细菌，藻类等；有以有机物为碳源，光为能源的光能异养型微生物如：红螺菌科的细菌（紫色无硫细菌）；有以二氧化碳为碳源，无机物为能源的化能自养型微生物如：硝化细菌，硫化细菌，铁细菌，氢细菌，硫磺细菌等；有以有机物为碳源，有机物为能源的化能异养型微生物如：绝大多细菌和全部真菌。
2、 产能途径的多样性
动植物通过糖酵解途径和三羧酸循环氧化葡萄糖分解成水和二氧化碳并释放能量，植物还通过非环式光合磷酸化的方式合成能量。而微生物产能的途径更为多，而且不同的微生物进行生物氧化所利用的物质不同，异养微生物利用有机物，自养微生物则利用无机物。
2.1.1异养微生物的产能途径
（1）EMP途径：以1分子葡萄糖为底物反应产生2分子丙酮酸，2分子NADH+氢离子和2分子ATP。EMP途径是绝多数生物所共有的一条主流代谢途径。
（2）HMP途径：是从葡糖-6-磷酸开始的，其特点是葡萄糖不经EMP途径和TCA循环而得到彻底氧化，并能产生大量还原型烟酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以及重要中间代谢产物。在多数好氧菌和兼性厌氧菌种都存在HMP途径，而且通常还与EMP途径同时存在。只有HMP途径而无EMP途径的微生物很少，例如弱氧化醋杆菌，氧化葡糖杆菌，氧化醋单胞菌。
（3）ED途径：以1分子葡萄糖为底物生成2分子丙酮酸，1分子ATP，1分子NADPH和NADH。其特点是只经过4步反应即可快速获得由EMP途径须经10步反应才能形成的丙酮酸。ED途径在革兰氏阴性菌中分布较广，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌中较多存在，是缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径。ED途径可不依赖于EMP途径和HMP途径而单独存在。
（4）TCA途径：以1分子丙酮酸为底物，经过一系列循环反应而彻底氧化，脱羧形成3分子CO2，4分子NADH2，1分子FADH2和1分子GTP，总共相当于15分子ATP，产能效率极高。这是一个广泛存在于各生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。
2.2自养微生物的产能途径
自养微生物的生物合成的起始点是建立在对氧化程度极高的二氧化碳进行还原（即CO2的固定）的基础上，为此，化能自养微生物必须从氧化磷酸化所获得的能量中，花费一大部分ATP以逆呼吸链传递的方式把无机氢转变成还原力。
而在光能自养微生物中，ATP是通过循环光合磷酸化，非循环光合磷酸化或紫膜光合磷酸化产生的，而还原力则是直接或间接利用这些途径产生的。
3、代谢产物的多样性。可分为初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。
4、微生物的代谢调节的多样性：酶合成的调节和酶活性的调节。