A. 生物素标记的DNA探针用什么方法检测
生物素标记的DNA探针用什么方法检测
以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板,人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段,可用来快速检测病原体.
怎么检测：
将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针.可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合,经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在.
以细菌为例,目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向.加之分子杂交技术的高敏感性,分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景.细菌的基因组大小约5×106bp,约含3000个基因.（各种细菌之间绝大部分DNA是相同的,要获得某细菌特异的核酸探针,通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法,即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库.然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选,产生杂交信号的克隆被剔除,最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段.将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定,亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能.）括号里比较重要!
B. 谁知道测DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多图片粘贴不过来，还不如你自己看。
一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。 CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的广泛研究。
近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很难设计。Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
从原理上来看，Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本，并用混合的PCR产物
作为校正。其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变。因而，用它处理样本后，再进行PCR扩增，甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理，它的基因频率为0－100％。在此，我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点。这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和精确性。实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测。这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的，而在肿瘤样本中高甲基化。通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段，并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）。使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物，其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替，以减少计算的数量。再通过人工检测测序引物可能存在的错配。此外，同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照，扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景。
PCR引物设计完全与模板相匹配，不覆盖任何甲基化多态性区域。使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段，扩增片段长度为144bp。反应体系为60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，终体积为50μL。PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环，最后一步延伸步骤在72℃下4分钟，中止反应。PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳动物基因组中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一种基因外修饰，不改变DNA的一级结构; 他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用. 全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象. DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
C. 生物上基因诊断的步骤是什么
1、核酸杂交：酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。其基本过程包括下列几个步骤。
（1）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。
（2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。
（3）杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。
（4）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。
D. DNA探针、DNA芯片
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问题描述:
它们的工作原理是什么？
解析:
DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。
DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。
当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNA-RNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。
由于DNA分子碱基互补的精确性，单连DNA探针仅与样品中变性处理的DNA单链出现配对杂交，由此决定了探针的特异性。
DNA芯片是一种缩小了的生物化学分析器。通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学处理结合，便可将成千上万的与生命相关的信息集成在一小块玻璃芯片上。
采用芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，以达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。通过分析可得到大量具有生物学、医学意义的信息。
关于DNA芯片的设想可追溯到1989年，当时美国Affymetrix公司的科学家打算用许多分子研制一种硬币般大小的装置。他们想出一种巧妙的办法，利用光刻法与光化学合成法相结合，在一块平滑的玻璃片上，用不同的分子构建一个高密度网络。开始，他们把某些蛋白质堆放在玻璃片上，一名叫斯蒂芬·福多的年轻科学家立即看出了采用DNA的可能性，他意识到，芯片上的DNA分子就好像一条条细细的分子“维可牢(velcro)”(“维可牢”是一种尼龙刺粘搭链，两面相合即粘住，一扯即分开，用以替代服装上的纽扣等)可选择性地与某些基因，即DNA的短片段结合，从而检查出变异型基因。福多在理论上推定，让未知的DNA样品与分布在DNA芯片上已知的DNA序列接触，就能对其作出鉴定。因为DNA双螺旋的两条单核苷酸链总是遵循“碱基互补”的原则配对，即一条链上的A总是与另一条链上的T相结合，C也总是与G相结合。因此，当一条链上的碱基序 *** 定之后，即可推知另一条链上的碱基序列。这类带有已知DNA序列的芯片就能检测突变基因或碱基的各种改变。
E. 怎样筛选目的基因
有4种方法：
1、从基因文库中获得目的基因.
方法：
第一步,通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来,进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行,如生物素、荧光素等）,即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针,与扩增出来的DNA杂交.
第二步,将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜）,然后,通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质,并使DNA固定在膜上.
第三步,按Southern杂交的方法进行杂交.
第四步,在X光底片上出现黑斑的菌落,这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法,有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）.
第五步,从该菌落中再提取目的基因.
2、PCR 筛选法方法：
第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃,使双链DNA模板两条链之间的氢键打开,变成单链DNA,作为互补链聚合反应的模板.
第二步：将反应体系降温至55～60 ℃,使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对,这个过程称为复性.
第三步：将反应体系升温至70～75 ℃,在耐高温的DNA聚合酶催化作用下,将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA链延伸,产生一条与模板链互补的DNA链.
上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的.
3、核酸杂交法、
DNA和DNA分子之间的杂交.目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中,这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键.如何证明这一点,就需要通过Southern杂交技术.基本做法是：
第一步,将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开；
第二步,将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；
第三步,用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；
第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光；
第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因.
4、免疫筛选法
Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交.它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法.具体做法是：
第一步,将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；
第二步,将表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出抗体（一抗）；
第三步,从转基因生物中提取蛋白质,走凝胶电泳；
第四步,将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；
第五步,将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合.由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带,所以加入一种称为二抗的抗体,它可以与一抗结合,二抗抗体上带有特殊的标记.如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性.
F. 如何验证生物素探针活性剂
用比色法。
1、用DNA稀释缓冲液，稀释生物素酰化标准DNA，浓度为0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同样稀释液处理待测DNA。
2、 对干硝酸纤维素滤膜：每个稀释度取1 μl 点膜，在80℃供干约1 h接步骤4。
3、 对于足龙膜：每个稀释度取1 μl 点膜，晾干后用紫外照射法将DNA交联至膜上。接步骤4或化学发光检测。
4、用少量体枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合适大小），用10 ml 封阻液，37℃封闭1 h 注意排出气泡。
5、稀释10 μl 亲和素-AP交联物至10 ml AP7.5。剪去封闭袋一角挤出封闭液，用亲和素-AP交联物代替，重新封口，在旋转平台室温揺荡10 min。
6、从袋中取出滤膜移到一个浅盘中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200m AP9. 5洗1次，10 min，轻微摇荡。
7、加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混匀。再加25μl50mg/ml BCIP，混匀。
8、在浅盘中避光温育溶液，不时观察直至发色达到满意程度为止。
9、加TE pH8，以终止反应，比较测定DNA样品和标准DNA的颜色强度以确定生物素酰化dNTP的掺入效率。如果该探计至少有一半标准品的强度，它可作为探针用于原位杂交。
G. 怎样用生物素标记dna
先用限制性内切酶在DNA上切出两个粘性末端，然后在DNA连接酶的配合下用与这个粘性末端相配的有标志性的（可以是放射性和荧光性等同位素一般属于放射性）DNA片段标记出来，简单地说就是这样～