怎么鉴定细胞污染的微生物

㈠ 细胞培养中如何识别细胞污染

细胞培养中细胞发生污染就是一个灾难，既耽误时间又伤神，熟练的无菌操作能避免许多问题，但早期检测污染也是一种可以预警的方法。对于培养箱中的每瓶细胞都要注意观察，要养成习惯，每次打开培养箱时，迅速看看有没有发生污染。

细菌、酵母、真菌、霉菌、支原体以及其他的培养细胞都可能引起污染。

一、肉眼观察

肉眼观察，把培养瓶或培养皿拿起来，对着光线检查。

浑浊情况。 即使细胞密度很高，培养基也应该是透明的。轻轻移动或晃动培养瓶，观察培养基的浑浊或悬浮情况，一些霉菌可能会在培养基的表面形成菌落。

培养基颜色的变化。 酸性条件下，加了酚红的培养基会由红变黄，而碱性条件下会变成红紫色。细菌污染常常会使培养基变成黄色，真菌污染会使培养基变成深紫红色。

闻！ 当然不能打开瓶子去闻，把鼻子贴在瓶口闻，许多污染发生以后都会散发出易察觉的、特殊的气味，甚至一打开培养箱门就闻到了。

二、显微观察

显微观察。在倒置显微镜下，先用低倍(10X) 再用高倍(40X) 物镜（总放大倍数为400) 观察细胞培养皿或培养瓶中的细胞。

其他有机体。 在低倍镜下，真菌的菌丝体成长棒状，并横穿整个视野，还可以观察到酵母，有时呈小圆球形，有时还有芽。在高倍镜下可以观察到细菌，它们可能是棒状或球状，单独成链或成团存在，它们也可能和细胞混在一起，并且明显处于细胞内部，有些细胞可能已经裂解变得模糊。观察时可能每两个视野才出现一个污染（当然也算被污染了！），而且可能污染物是可以运动的。

损伤细胞。 感染会杀死细胞，可能导致每个细胞都裂解和／或细胞层从附着物上完全剥离，更可能的是细胞变得不规则（或大或小），在低倍镜下是黑色的粒状。

悬浮培养细胞比贴壁培养细胞更加难以显微观察，尤其是高倍显微镜下。

将培养瓶或培养皿放在显微镜的载物台上，静置一会。

将焦距对准器皿的底部，观察那些轻微附着的细胞，因为它们可能已经接触到了微生物。

对准整个培养瓶焦距，当发现细胞的时候，用细聚焦调节旋钮调节，仔细检查周围的培养基有没有污染发生。

三、交叉污染

细胞还可能被别的细胞污染，这种交叉污染可能更广泛，许多实验人员在不经意之间培养、使用和冻存了其他的细胞。

如何避免交叉污染：

只从有保障的地方得到细胞，或者自已检查细胞。

不要同时操作多株细胞。不要把多种培养瓶同时放在超净台内。

不要使用同一个移液管操作多种细胞。

不同细胞株不要使用同一瓶培养基或胰蛋白酶。

操作后不要把移液管放回培养基的瓶中。

培养维护时，使用栓塞式移液管。

四、支原体污染

支原体污染 是一种很难发现却经常存在的问题。

支原体是最小的（0.3 μm）能够自我复制的有机体，倒置显微镜下通常观察不到。

支原体没有细胞壁，对常用的抗生素不敏感。支原体感染是极为不易察觉的，可能直到出现了可以观察到的病变或发现细胞正常功能丧失的时候，才意识到是发生了支原体感染。

在没有采用特殊的染色方法，也没有观察到病变的情况下，实验总是不成功，就应怀疑被支原体污染。预防支原体污染的惟-途径是经常对细胞进行筛选。

支原体个体很小，需要使用透射电镜才能清晰看到其结构及分布。

注意：如果你发现了支原体污染

最好的方法是立即把细胞丢弃，从新复苏。

可以不理会它。

可以采取某些挽救措施，但是会很困难，只适用于那些不可代替的细胞。最简单的方法是订购 支原体清除试剂盒 。

如果你不能确定是否发生了污染

制作湿涂片或染色片。取1 ml 培养基离心，用50 μl 培养基或缓冲液重新悬浮细胞，滴一滴到载玻片，盖上盖玻片制成湿涂片；或涂片、固定并染色（甲基兰或革兰氏染液），在高倍镜下观察。

将细胞在营养培养基或琼脂培养基上划线， 37℃培养3 天。如果有菌落，那么细胞被污染了。

取1 ml 的细胞培养液至无菌的微量离心管中， 37℃培养3 天。观察到浑浊物，做湿涂片显微镜观察。

㈡ 微生物检测或鉴定技术或方法有哪些

微生物检测或鉴定技术或方法有哪些
通过显微镜直接观察。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。（见高中生物选系1《生物技术实践》图2-8）因此可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。
使用选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件。选择培养基，顾名思义其作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。例如，使用以尿素作为唯一氮源的培养基能够培养出可合成脲酶的微生物；在培养基中PH调至酸性有利于霉菌的生长繁殖（抑制细菌的生命活动）等。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用类型或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。
使用鉴别培养基。即根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。例如，水质检验中大肠杆菌的检验（大肠杆菌的存在数量用以衡量水被粪便污染的程度）就用到了伊红—美蓝试剂，该试剂与水或乳制品中的大肠杆菌反应出现深紫色且带有金属光泽，属于大肠杆菌的特征反应。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。

㈢ 传统鉴定方法如何将环境中的微生物鉴定到属

简单的分为3步
1）观察菌落形态
2）菌体形态
3）生理生化反应

㈣ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。