A. 微生物的扩大培养为什么要得到由单个细胞繁殖而来的菌落呢
有时单菌落很多次，你可以从单细胞繁殖，它必须重复分离纯种的方法有很多你第一次面临着非常全面的，可以看看。
微生物实验室分离纯化方法日期:2010-03-01浏览次数：18
混合微生物种群仅包含某一种或一个微生物过程称为微生物的分离和纯化。在分子生物学的研究和应用，不仅
只包含一个特定的方法或微生物的过程称为微生物的分离和纯化，混合微生物种群中分离。在分子生物学的研究和应用，不仅通过混合的天然微生物的分离和纯化技术分离出特定的微生物，但也一定要注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，以防止其他微生物的污染。
1，与固体培养基中分离和纯化
单个微生物的合适的固体介质的表面或内部生长，繁殖，在一定程度上，可以形成可见的，是一个一定的形态结构的子细胞生长组称为菌落。即使当表面的固体培养基许多菌落到细菌的草坪成为此。不同的微生物的生长和形成的菌落在一个特定的介质或细菌草坪通常有稳定的特点，可以成为微生物的分类和鉴定的重要依据。大多数细菌，酵母，以及许多真菌和单细胞藻类，形成孤立的固体培养基上的菌落，用一个合适的片剂分离方法是很容易获得的纯培养。所谓的平面，即培养板中提到的，它是指在固体培养基倒入无菌的陪替氏培养皿中，并冷却和固化后，盛固体培养基平板。此方法包括一个单一的分离微生物，并固定在固体培养基的表面或内部的。固体培养基凝固与琼脂凝胶材料中，每一个独立的活微生物的生长，繁殖，形成菌落，菌落形成可移植的。最常见的分离，培养的微生物琼脂固体培养基上是一个坚实的中小板。容易被科克成立100多年来，一直是最常见的手段的不同菌株板分离微生物纯培养。
1.1稀释倒平板法
第一个微生物悬浮液了一系列的稀释（如1:10,1:100,1:1000,1:10000），然后稀释剂一点，并已熔化和琼脂培养基冷却至50℃或约混合，振摇后，倾入消毒的陪替氏培养皿，直到在琼脂凝固后，使细菌的琼脂平板中，并培养一定的时间，可能会出现的菌落。如果稀释适当地在平坦的表面上出现或琼脂培养基中，可以分散的单个菌落，菌落可能传播由细菌细胞中，就形成了。然后挑取单个菌落，或重复以上操作数次，就可以得到一个纯粹的文化。
1.2扩展板的方法可以很容易地导致死亡的一些热敏感的菌株，并利用微生物悬浮液加入热介质，然后倒平板电脑也导致一些稀释倒平板法严格的需氧细菌缺乏氧气由于固定在琼脂中间影响其生长，因此纯种的分离方法是微生物学研究的扩散板方法中使用。其做法是第一熔融培养基倾入无菌的陪替氏培养皿中，以制备无菌的片剂，冷却和固化后，一定量的微生物的悬浮液逐滴加入到在平板表面，然后作为一个无菌玻璃从整个板的表面均匀地分散涂布棒杆菌，拾取单个菌落培养后（图1）。
图1扩展板的方法
1.3平板划线法
最简单的方法分离的微生物平板划线法，即接种环无菌精选小料要分开的连续划线无菌平坦面（图2），微生物细胞的数目将减少与划线的数目增加，并且逐渐分散，如果越过如果合适，该微生物可以11分散后的培训，上述平面板的表面上，得到单菌落。有时单菌落，它必须重复多次，然后才能得到纯种分离的单细胞繁殖。其原理是，微生物的样品多次的固体培养基的表面达到分离的目的，从点到线“稀释”。划线的方法很多，常见的容易出现的单菌落划线的斜杠法曲线法，网格法，辐射，四格的方法。
图2平板划线法
1.4稀释摇管
固体培养基分离严格厌氧菌的特殊性，，如果机体暴露在空气中立即死亡，可以准备通常的方法平板，然后放置在一个封闭的容器中培养，并在容器中的氧气可以是化学，物理或生物的方法来清除。对于那些谁是更敏感的氧厌氧微生物纯培养，分离培养法都不能动摇稀释管，它是另一种形式的稀释倾注法。管加热的第一串联盛无菌琼脂培养基琼脂熔化后，冷却并维持在50℃左右，梯度稀释的材料，可以与这些管分离，管快速摇动均匀，冷凝后，在琼脂表面倾倒灭菌的液体石蜡和固体石蜡，介质和空气的混合物的柱层被分离。培养后，形成的菌落在琼脂上在中间的列。挑取单菌落，移植，需要使用无菌针头盖和用毛细管插入琼脂和它们之间的壁进入无菌无氧气体中除去液体石蜡 - 石蜡，琼脂柱吸出，放置在陪替氏菜用无菌刀琼脂柱切成薄片观察和殖民地移植。
2，用液体培养基中分离和纯化
大多数细菌和真菌分离使用的板方法通常是令人满意的，因为它们是在固体介质中的大多数物种上看起来很不错。然而，迄今为止，不是所有的微生物，可以在固体培养基上生长，例如，一些大的细菌的细胞，许多原生动物和藻类等，这些微生物需要使用液体介质中分离，得到的纯培养。使用液体培养基中分离和纯化的
稀释法。在液体培养基中，接种物的顺序稀释以获得高程度的稀释效应，少于一个微生物是在试管中分配。大多数的管子，如果稀释后没有微生物的生长，并在体外培养中得到的微生物的生长可能然后有一个纯培养。稀释后管的比例将大幅增加微生物的生长，获得纯培养的降水。因此，稀释法，固液分离，必须在许多平行试管稀释，大部分（一般应不超过95％）表明没有增长。
3，
分离的单细胞（孢子）只能从该总数的类型的混合微生物种群的优点是被隔离的稀释方法的一个重要的缺点。在自然界中，许多微生物在混合组是少数。在这种情况下，您可以采取的显微切割法直接分离细胞或单个个体进行培养，获得纯培养物，被称为单细胞（或单孢子）分离方法，从一个混居的。单细胞分离难度和细胞或个人的大小成反比，较大的微生物，如藻类，原生动物更容易，个别的小细菌是困难得多。的
较大的微生物，可以使用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌介质转印洗涤数次除去较小的微生物污染。此操作可以在低倍率的显微镜进行，如在解剖显微镜下。相对小的单个微生物，需要在显微镜下使用显微操作使用毛细管或微观的针，钩，环拾取一个单一的微生物细胞或孢子，得到纯培养。在显微镜下的显微操作在没有单细胞分离，也有一些替代的方法可以使用??，例如，可以通过适当稀释的样品制备后成小液滴，在显微镜下观察到的，并只选择一个单元格含有液体纯培养分离。分离的单细胞操作技术有更高的要求，使用大多限于高度专业化的科研。分离
4，选择培养的培养基或培养条件没有能够满足所有的微生物的生长的需要，所有的培养基中选择在一定程度上性质。如果在某种微生物的生长需要是已知的，可以设计适合于该微生物的生长的特定的环境，从而能够以该微生物选自混合微生物种群进行培养，虽然在混合微生物种群种微生物可能是是少数。等的分离，在被称为选择培养分离，特别是适合于从自然界分离的，找到有用的微生物的微生物的纯培养的技术通过选择培养。自然，在大多数场合中的微生物群落是由各种各样的微生物，分离所需的特定的微生物是非常困难的，尤其是当存在时相比，以非常小的其他微生物的量和一定的微生物种，单用途板在一般的稀释方法几乎是不可能的。这种微生物的分离，必须基于的特性的微生物，包括营养，生理，生长条件，培养菌株。或抑制大多数微生物不能生长，或造成这种微生物的成长环境，有利于社区的数量的增加，因此，在一定的时间来培养板稀释的纯培养??分离细菌。
4.1使用在选择平板
直接分离，根据被分离微生物功能选择不同的培养条件下，也有各种方法可以使用??。要分开，例如，嗜热菌，可以在高温条件下培养;分离某些抗生素的耐药菌株，并用抗生素，可以分离成板，一些微生物，如螺旋体，粘细菌，蓝藻等在的琼脂平板的表面。或的士车厢内，他们可以利用的滑动特性的分离和纯化，因为滑行可以让自己和其他微生物不能单独移动。板的微生物群落，使微生物在跑道上滑行滑行前挑接种反复进行，以获得一个纯粹的文化。
4.2富集培养
富集培养的原则和方法是很简单的，不同利用不同的微生物的生命活动的特点，制定具体的环境条件下，唯一的条件相适应的微生物强劲的增长，它在社会上，可以很容易地分离到所需的特定微生物数量大大增加。富集条件可以根据需要分离的物理，化学，生物，和集成的许多方面，如温度，pH，紫外线，高的压力，光，氧气，营养等许多方面的微生物的特性选择。在相同的培养基和培养条件下，它是容易反复移位的物种的菌株后，在固体培养基上生长，并最终浓缩的单个菌落。如果你想分开一段寄生菌的样品接种到相应敏感宿主细胞群体，有很大的增长。通过反复移动的物种可以得到纯寄生菌。
5，二元文化
分离，得到纯培养的目的。然而，在某些情况下，这是很难做到的。但可用的二进制文化作为替代品的纯化和培养。文化包含两个或更多种微生物混合培养作为一个已知的，并仅含有2种微生物的培养，但也有是同时保持意识文化称为二进制文化之间的特定关系。如二进制文化是最有效的方式来保存病毒，因为病毒是细胞生物的严格细胞内寄生。有些细胞和微生物也有严格的生物细胞内寄生物，或特殊的共生关系。这些微生物，二元文化是最接近的纯培养物的培养方法，在控制的条件下，可以在实验室中实现。此外，原生动物大鳄微小的微生物很容易在实验室培养的方法与双文化，文化的微生物原生动物和狩猎。例如，纤毛虫，变形虫和粘菌。
几种方法如上所述，平板分离方法一般用于实验室微生物的分离和纯化。在固体培养基上的单个菌落的微生物的生长和形成，通常是由一个细胞组件制成的复制品。单菌落被选中，并获得一个纯粹的文化。可以通过稀释涂布平板或板裸奔技术的方法，以获得单个菌落。值得注意的是，通过在平板上生长的单个菌落，分离从微生物种群不一定可以保证的纯培养。因此，纯文化的决心，除了观察菌落特征，但也与显微镜检查，以确定个体的形态特征，一些纯培养的微生物通过一系列的分离和纯化过程，以及各种特性，以获得。
B. 为什么要进行微生物菌种改良，有哪些方法
微生物的代谢产物或者其本身的菌种特性能够为人们利用，在生物医药，食品和发酵行业有着不可替代的作用，但是，刚从自然界分离得到的菌种，原始特性不能满足大规模的需要，因此，通过菌种改良的方法筛选菌种，能够降低生产成本，满足大规模生产需要。
菌种育种方法很多，有推理育种，基因组重排，原生质体融合，抗性筛选，代谢工程等多种方法。
C. 3 微生物发酵生产的工厂，为什么都要进行菌种的扩大培养，一般如何进行菌种的扩大培养
在微生物发酵生产时，为保证足够的接种量，常采用菌种的扩大培养。
用以生产的菌株第一步要在实验室环境下培养达700ml以上菌种时，接入一级种子罐种培养1-2天后，输入二级种子罐培养1-2天，再输入发酵罐中培养7天左右。
发酵时出现产量不稳定由多种因素引起，种子质量，接种量，原材料的质量，在发酵过程中糖、氮的补充，发酵控制条件不成熟等。
原材料的影响不大，除非是卖到发霉变质的，或者是质量严重不合格的原材料。
本人认为重要可能是发酵过程中糖氮的补充，掌握不成熟。易引起发酵产量不稳定。
D. 微生物培养实验菌种来源
不知道你为什么要做这个微生物培养的实验，一般做微生物培养是为了从病人的无菌体液中分离出细菌（这个一般为单一细菌，例如脑脊液，血液，胸腹水等），这些体液经过无菌采集后涂于相应微生物培养基上；还有就是从有正常菌群生长的人体排泄物中分离出致病菌（例如痰液，粪便等）。上述标本经过分区划线在最后一区会得到单个的菌落，这些单个的菌落就是单一的菌种。
E. 生理生化实验，为什么选用大肠杆菌，枯草芽孢杆菌作为试验菌
实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。三、试剂与器材1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。六、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?4.培养基的配制原则是什么?实验二土壤中微生物分离纯化培养一、实验目的掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。三、试剂与器材1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基四、实验内容1.土壤稀释液的制备2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术五、关键步骤及注意事项1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。六、思考题1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。2.如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。实验三菌种保藏一、实验目的1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。二、实验原理微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法三、试剂与器材1.材料大肠杆菌、青霉菌、放线菌2.试剂液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰3.器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。四、实验内容1.斜面保藏法2.液体石蜡法3.穿刺保藏法4.砂土管保藏法5.冷冻真空干燥保存法五、关键步骤及注意事项1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。2.熔封安瓶时防止封闭不严。3.液氮冻存操作应防止冻伤。六、思考题根据你自己的实验。谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊?实验四细菌形态观察及单染色一、实验目的1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。4.初步认识细菌的形态特征。二、实验原理细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。三、试剂与器材1.材料大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2.试剂吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。3.器材显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。四、实验内容简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检五、关键步骤及注意事项1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。六、思考题1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环币?2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?实验五放线菌及霉菌形态观察一、实验目的1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。二、实验原理放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。三、试剂与器材1.材料黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。2.实验器材经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。四、实验内容倒平板→接种→插片→培养→镜检五、关键步骤及注意事项1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。2.插片时要有一定角度并与划线垂直。3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。六、思考题1.镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2.你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？实验六革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。4.学习显微镜(油镜)的使用方法。5.初步认识细菌的形态特征。二、实验原理革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、试剂与器材1.材料：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物2.试剂革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液)。5％孔雀绿水溶液3.实验器材小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。四、实验内容1.革兰氏染色法制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检。2.Schaefer-Fulton氏染色法制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检。五、关键步骤及注意事项1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。六、思考题1.你认为要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么?2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。3.你的染色结果是否正确?如果不正确，请说明原因。4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因?5.说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定一、实验目的1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。2.学习鉴别死活细胞的实验方法。二、实验原理酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。三、试剂与器材1.材料酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomycescalsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。2.试剂0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。3.器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。四、实验内容1.美蓝浸片观察酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检2.水-碘浸片观察五、关键步骤及注意事项1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。六、思考题1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌?实验八微生物直接计数法及测微技术一、实验目的1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。二、实验原理显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N•M(个)微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。三、试剂与器材1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。四、实验内容1.微生物直接计数法菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板2.微生物测微技术装目镜测微尺→校正→菌体大小测定五、关键步骤及注意事项1.防止加样空气泡产生。2.调节显微镜光线的强弱适当。六、思考题1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确?2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?实验九大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。二、实验原理将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。三、试剂与器材1.材料与试剂大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管(5ml／支)、剩余60ml装入250ml的三角瓶。2.器材722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。四、实验内容编号→接种→培养→比浊测定五、关键步骤及注意事项1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定2.严格控制培养时间六、思考题1.根据实验数据画出生长曲线，并说明大肠杆菌生长特征。2.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点7．3.次生礼谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累?实验十水中细菌总数的测定一、实验目的1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2.了解水源水的平板菌落计数的原理。二、实验原理本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、试剂与器材1.试剂牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水2.器材灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、实验内容1.水样的采取2.细菌总数测定3.菌落计数方法五、关键步骤及注意事项1.注意全过程防止染菌六、思考题从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？实验十一细菌细胞的生化反应实验一、实验目的了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法。二、实验原理各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH5．2为黄色，pH6．8为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证．三、试剂与器材1.材料大肠杆菌、普通变性杆菌、产气杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。2.试剂甲基红试剂、40％KOH、5％a一萘酚、乙醚、吲哚试剂。3.实验器材德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱。四、实验内容培养基配制→编号→试管→接种→培养→观察结果五、关键步骤及注意事项1.要严格按照培养基配方配制培养基。2.观察结果时要注意滴加药量及反应时间。六、思考题1.哪些生理生化试验可用于区别大肠杆菌和产生肠杆菌?结果如何?2.做糖发酵试验时应注意哪些问题?3.甲基红试验和伏一普试验的最终产物如何?为什么会出现不同的最终产物?实验十二噬菌体的分离、纯化及效价测定一、实验目的1.学习分离、纯化噬菌体的原理和方法2.观察噬菌斑的形态和大小3.掌握噬菌体效价测定的基本方法二、实验原理噬菌体是细菌的专性寄生物，自然界中凡是有细菌存在的地方，均可以发现其特异性的噬菌体，噬菌体侵入细菌细胞后，利用宿主细胞的酶系统进行复制和增殖，最终导致细菌细胞裂解，噬菌体从细胞中释放出来，可以进一步侵染细菌细胞。在液体培养基中，噬菌体可以使浑浊的菌悬液变为澄清。在长有宿主细菌的固体培养基平板上，噬菌体可以裂解细菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此可以利用这个性质对噬菌体进行分离和效价的测定。噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，即一毫升培养液中所含有的噬菌体数量。噬菌体效价的测定方法多采用双层琼脂平板法。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。三、试剂与器材1.材料大肠杆菌、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含有琼脂0．5％，试管分装，每管3～5m1)、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基。2.器材培养皿、无菌吸管、三角瓶、抽滤瓶、蔡氏细菌滤器、真空泵、阴沟污水。四、实验内容噬菌体分离→噬菌体纯化→效价测定五、关键步骤及注意事项1.噬菌体时要注意细菌滤器的型号。2.纯化噬菌体时要注意形态、大小。3.效价测定时要注意双层琼脂平板法的使用技巧。六、思考题1.在固体培养基平板上为什么能形成噬茵斑?2.从固体培养基平板上得到的噬菌斑数目，如何计算噬菌体的效价？
F. 微生物实验微生物实验为什么洗细菌
防止被其他杂菌污染,影响实验结果.杂菌是在微生物的分离、及纯培养过程中出现的与分离培养菌种不同的其他菌种。1、竞争性杂菌主要是一些腐生性真菌，在培养料中与食用菌争夺养料、水分和氧气等，尤其是在栽培管理中的早期阶段更易侵占菌块，分泌毒素，抑制食用菌体的扩展和蔓延。2、侵染性与非侵染性病害 侵染性病害包括真菌、细菌病害和线虫病害等，它们都可以侵染食用菌体，造成菌丝萎缩和子实体腐烂。非侵染性病害主要是由一些不适宜的理化因素，如营养不良、水分供应失调、温度过高或过低、日照过强或不足及有害物质引起的中毒所造成的生理紊乱。3、竞争性杂菌包括青霉、木霉、曲霉、链孢霉、毛霉和根霉等。在栽培过程中可以从杂菌的颜色、气味、拮抗线三个方面来识别。
G. 为什么选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为常用的试验菌
首先从微生物形态上分类：大肠为杆菌，金葡为球菌，枯草为产芽孢杆菌，主要为了区分杆菌、球菌、芽孢的不同形态受到的影响。
从实验耐受性上分类，枯草的耐受力大于金葡，金葡大于大肠，根据耐受力的不同而研究。
从鉴定意义上，大肠、金葡以及枯草是非常常见的菌株，属于模式菌株，更据有研究意义。
H. 所有微生物检验都要用到标准菌株吗
所有微生物检验都要用到标准菌株。
标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。
标准菌株的复活或培养物的制备应按照供应商提供的说明或按已验证的方法进行。