如何抽取原核生物rna

❶ 原核生物的RNA在哪里DNA在哪里

DNA在原核生物的拟核内，但有个例外，细菌是单细胞的原核生物，细胞质内含有质粒，质粒是小型环状DNA分子。
RNA在原核生物的细胞质基质和核糖体内都有，像转移RNA在基质里，信使RNA在核糖体里。
另外，在拟核区，也有RNA，是转录中的RNA。

❷ 原核生物也能转录出RNA

原核生物的基因组成
原核生物基因分为编码区与非编码区。
[编辑本段]编码区与非编码区的定义及位置
所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质。非编码区则相反，但是非编码区对遗传信息的表达是必不可少的，因为在非编码区上有调控遗传信息表达的核苷酸序列。
非编码区位于编码区的上游及下游。在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA。，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

❸ 真核生物（如小鼠）的质粒如何提取，请写下详细步骤，谢谢

对于小鼠来说，质粒只存在于线粒体中
质粒提取可分为三个部分
1 裂解细胞
2 质粒DNA与染色体DNA的分离
3 纯化

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小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

1 材料和方法

1.1 实验动物 Balb-c小鼠，6周龄, 雌性, 购自北京大学医学院实验动物部。

1.2 质粒、菌株、细胞株和主要试剂 质粒pEGFP-N1、pGEM-T载体质粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293细胞株（本元正阳）。AdMaxTM Kit E试剂盒（Microbix Biosystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA连接酶（Takara公司）。限制性核酸内切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 试剂、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆转录试剂盒、PCR Master Mix（MBI）。质粒提取、胶纯化试剂盒（QIAGEN）。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。

1.3 构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒

1.3.1 小鼠脾脏总RNA的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，方法按产品说明进行。

1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制备：以小鼠脾脏总RNA为模板，oligo-dT为引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA为模板，用CD40和mIgG Fc特异引物进行PCR扩增，另以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增，引物及PCR反应条件见表1，分别获得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。

1.3.3 质粒pGEM-IgG的构建：将IgG Fc的PCR产物与pGEM-T质粒进行TA连接反应，即10μl PCR产物加2μl的pGEM-T载体加10 U的T4连接酶，16 ℃过夜。取2μl的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培养基（含氨苄青霉素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振荡培养过夜，提取质粒pGEM-IgG并测序。

1.3.4 质粒p516-IgG的构建：用Bgl II分别消化pGEM-IgG和pDC516，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将IgG片段和pDC516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加T4连接酶16 ℃过夜进行连接反应。取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），将PCR阳性的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。

1.3.5 质粒p516-CD40-IgG融合基因的构建：用Xma I分别消化CD40的PCR产物和p516-IgG，将CD40片段和pDC516-IgG 线性载体进行连接（方法同上）。转化大肠杆菌DH5α后，用pDC516-f和CD40-r引物组合进行菌落PCR筛选（见表2），将阳性结果的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。

1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：用Hind Ⅲ分别消化GFP的PCR产物和pDC516-CD40-IgG，将GFP片段和pDC516-CD-IgG 线性载体进行连接反应（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），提取质粒并测序。

1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的大量制备：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification试剂盒说明进行制备，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实（见图2），紫外分光光度仪测OD值，过滤除菌后-20 ℃保存备用。

1.3.8 重组质粒转染293细胞：在6孔板中将2.0×105个细胞接种于2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，使细胞在转染时铺满平板的60%～70%。用Lipofectamine 2000转染试剂介导重组质粒转染，在无菌EP管中准备A、B两种溶液。A液：将4.0μg DNA溶于250μl无血清DMEM中，轻轻混匀；B液：将10μl Lipofectamine 2 000溶于250μl无血清培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min。将A液和B液混合并混匀，室温孵育20 min，以形成脂质体/DNA复合物。换去6孔板中旧的培养液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500μl脂质体/DNA复合物。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后换液。

2 结果

2.1 获得小鼠CD40胞外区、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r经PCR扩增的小鼠CD40胞外区基因片段为572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r经PCR扩增的小鼠IgG2a Fc段为700 bp；引物GFP-f和GFP-r经PCR扩增的GFP基因片段为765 bp。琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表达质粒的成功构建

2.2.1 pDC516-IgG的构建：pGEM-T载体为3 000 bp的质粒，构建的pGEM-IgG质粒为3 700 bp。pGEM-T质粒的多克隆位点上游110 bp处含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物组合可扩增出约810 bp的片段，用T7 primer测序证实IgG序列的正确性。将IgG片段和pDC516线性载体进行连接反应，用pDC516-f测序证实IgG插入序列的正确性（见图3）。

2.2.2 pDC516-CD40-IgG的构建：将CD40片段和pDC516-IgG线性载体进行连接反应，用引物pDC516-f测序证实CD40插入序列的正确性。

2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：将GFP片段和pDC516-CD40-IgG 线性载体进行连接反应，用pDC516-r测序证实GFP插入序列的正确性。CD40-IgG-GFP含酶切位点的融合产物为2001bp，编码667aa（见图4）。

2.3 重组质粒在真核细胞内表达 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒抽提后在紫外分光光度计下检测到OD值为0.1257。将该质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞的第4天开始可见零星的细胞上有GFP表达，随着时间的延长，GFP表达的细胞量逐渐增多，第7天左右在荧光显微镜下见大量的细胞有绿色荧光发生（见图5）。

参考资料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html

❹ 原核细胞RNA转录过程

原核细胞，没有以核膜为界分开细胞核，细胞核与细胞质基质在同一空间，转录过程与真核细胞是一样的，在转录酶(RNA聚合酶)的作用下，核糖核苷酸与拟核碱基互补配对形成单链的RNA
RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子,开始转录，在原核生物基因上通常有一段终止序列即终止子；RNA合成就在这里终止

❺ 原核生物有RNA

原核生物也有rna，是由拟核转录出来的。
这个知识点 可以记为：有细胞结构的生物 都有dna和rna

❻ 简述原核生物DNA复制，RNA转录及蛋白质翻译的详细过程。

DNA复制，RNA转录及蛋白质翻译的详细过程：有细胞的生物，都是遵循“DNA自我复制→转录→翻译”的。

遗传物质是一条不与组蛋白结合的环状双螺旋脱氧核糖核酸（DNA）丝，不构成染色体（有的原核生物在其主基因组外还有更小的能进出细胞的质粒DNA）。

在蛋白质合成过程中起重要作用的核糖体散在于细胞质内，核糖体的沉降系数为70S。大部分原核生物有成分和结构独特的细胞壁等等。总之原核生物的细胞结构要比真核生物的细胞结构简单得多。

(6)如何抽取原核生物rna扩展阅读：

原核生物细胞能进行有氧呼吸。有的原核生物，如硝化细菌、根瘤菌，虽然没有线粒体，但却含有全套的与有氧呼吸有关的酶，这些酶分布在细胞质基质和细胞膜上，因此，这些细胞是可以进行有氧呼吸的。利用细胞膜和细胞质的酶系进行有氧呼吸。

第一个阶段发生的场所在细胞质内，产生的丙酮酸进入三羧酸循环，被彻底氧化生成二氧化碳和水，同时释放大量能量.因其呼吸链组分在细胞膜上，所以主要在细胞膜上进行。

有的原核生物如产甲烷杆菌等，没有与有氧呼吸有关的酶，因此，只能进行无氧呼吸。总之，大多数原核生物能进行有氧呼吸。

❼ 原核生物怎么进行转录

RNA的转录过程一般分两步，第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。但原核生物mRNA的原始转录产物一般不需后加工就能直接作为翻译蛋白质的模板。
启动
RNA聚合酶正确识别DNA模板上的启动子并形成由酶、DNA和核苷三磷酸（NTP）构成的三元起始复合物，转录即自此开始。DNA模板上的启动区域常含有TATAATG顺序，称普里布诺（Pribnow）盒或P盒。复合物中的核苷三磷酸一般为GTP，少数为ATP，因而原始转录产物的5′端通常为三磷酸鸟苷（pppG）或腺苷三磷酸（pppA）。真核DNA上的转录启动区域也有类似原核DNA的启动区结构，和在-30bp（即在酶和DNA结合点的上游30核苷酸处，常以—30表示，bp为碱基对的简写）附近也含有TATA结构，称霍格内斯(Hogness)盒或 TATA盒。第一个核苷三磷酸与第二个核苷三磷酸缩合生成3′-5′磷酸二酯键后，则启动阶段结束，进入延伸阶段。
延伸
σ亚基脱离酶分子，留下的核心酶与DNA的结合变松，因而较容易继续往前移动。核心酶无模板专一性，能转录模板上的任何顺序，包括在转录后加工时待切除的居间顺序。脱离核心酶的σ亚基还可与另外的核心酶结合，参与另一转录过程。随着转录不断延伸，DNA双链顺次地被打开，并接受新来的碱基配对，合成新的磷酸二酯键后，核心酶向前移去，已使用过的模板重新关闭起来，恢复原来的双链结构。一般合成的RNA链对DNA模板具有高度的忠实性。RNA合成的速度，原核为25～50个核苷酸/秒，真核为45～100个核苷酸/秒。
终止
转录的终止包括停止延伸及释放RNA聚合酶和合成的RNA。在原核生物基因或操纵子的末端通常有一段终止序列即终止子；RNA合成就在这里终止。原核细胞转录终止需要一种终止因子ρ（四个亚基构成的蛋白质）的帮助。真核生物DNA上也可能有转录终止的信号。已知真核DNA转录单元的3′端均含富有AT的序列〔如AATAA(A)或ATTAA(A)等〕，在相隔0～30bp之后又出现TTTT顺序（通常是3～5个T），这些结构可能与转录终止或者与3′端添加多聚A顺序有关。

❽ RNA的提取方法步骤及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

(8)如何抽取原核生物rna扩展阅读

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

❾ 如何寻找转录起始位点，promoter基本结构，原核生物1RNApol识别

（1）启动子序列
A：原核生物启动子序列：包括：
①CAP-cAMP结合位点：结合CAP-cAMP,调节基因转录；
②RNA聚合酶进入位点：a：在转录的-35附近,一个Sextama框,是RNA聚合酶的识别和初始结合位点；b：在转录的-10附近一段核苷酸序列,TATA序列,称为Pribnow框,是RNA聚合酶的结合位点.
B：真核生物启动子序列（以RNA聚合酶Ⅱ启动子为例）
a:帽子位点：转录的起始位点
b：TATA框,又称Hogness框,－25,类似于原核生物的Pribnow框,决定了转录起点的选择.
c：CAAT框：－75附近,控制着转录起始的频率
d：增强子：－100以上,对转录起着调节作用.
（2）终止子序列：在在正确的时间和地点终止转录作用.