生物活性的测定常用方法有哪些

A. 试述细胞因子的生物学检测法原理，常用的方法有哪些

细胞因子的生物学检测法是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，由于各种细胞因子具有不同的生物活性，因此可选择某一细胞因子独特的生物活性，对其进行检测。生物学检测法又称为生物活性检测法，可分为以下几类：细胞增殖法、靶细胞杀伤法、细胞因子诱导的产物分析法、细胞病变抑制法等。该法比较敏感，并能直接测定生物学功能，属于一种最可靠的方法，是科研部门最常用的技术，需要长期培养依赖性细胞株，步骤繁杂，影响因素多，是这一方法的缺点。

B. 生物活性的活性检测

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：
1.SBF 配置
由于SBF 溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个 1000ml 的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好 700ml 离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至 36.5±1.5C。
按表1所列顺序在 36.5C 恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程
表1 配置1000 ml SBF 溶液时试剂添加顺序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力测试
对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到 2mm 应用如下公式计算出 SBF 用量：
Vs=Sa/10,
Vs（ml）是 SBF 的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。
对于多孔材料，SBF 的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的 SBF 体积量加热到 36.5C， 然后按示意图往里放置样品。 笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图 1(a)，1(b)。少数情况下，SBF 溶液会生成同 质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图 A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的 下表面。 四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥 器中常温干燥。
图1 SBF中样品浸泡示意图 1.四唑盐（MTT）比色法：
检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。
●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。
●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
● 制备细胞悬液：细胞计数
● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

C. 生物制品鉴别实验包括以下哪些方法

二、指采用生物学方法，的测定方法。以下为生物学测定常用方法，根据具体情况，在产品的常规质控时可采用其中的一种或几种。鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定。（一）、酶反应试验是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果比较准确。（二）、结合试验是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小。（三）、细胞测定试验是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。（四）、动物试验是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。

D. 请教各位那些技术可以测定微生物活性

土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
土壤呼吸强度和纤维分解强度是土壤微生物活性的重要标志，反映了土壤中微生物活性及对有机质残体分解的速度和强度。纤维素分解强度采用埋片法；呼吸强度采用碱吸收滴定法。土壤微生物活性用土壤呼吸CO2测定法（5g鲜土于310mL试剂瓶中，22℃24h测CO2释放量(用exH23os红外CO:分析仪测定)）。直接测定土壤呼吸的方法基本可分为静态气室法、动态气室法和微气象法三种。
土壤酶大多数来自土壤微生物，在土壤中已发现50—60种酶，它们参与并催化土壤中发生的一系列复杂的生物化学反应。如水解酶和转化酶对土壤有机质的形成和养分循环具有重要的作用。已有研究表明，土壤酶活性和土壤结构参数有很好的相关性。土壤微生物酶主要有脱氢酶、磷酸酶、精氨酸酶及芳基硫酸酯酶等。

E. 生物活性物质常用的分析方法有哪些

依据生物活性物质分子本身的理化特性,如溶解度、带电性、大小、挥发性等进行分离纯化，
植物的活性物质的提取多采用：溶剂法、水蒸汽蒸馏法、超临界二氧化碳提取分离法、萃取法。分离多用硅胶柱色谱法。
动物的生理活性物质提取分离比较复杂,方法多种：如盐析法、电泳法、高速离心法、受体识别法等.

F. 化合物对生物活性测试的方法

酶标仪啊，测量OD值，或者做生长曲线。这些都是专门针对生物活性测量的方法。最原始的就是分光光度计比色法也行啊

G. 生物活性成分的筛选方法都有哪些

1、压榨法。2、用溶剂去萃取。3、蒸馏法。4、压榨。5、蒸发。6、过滤。7、溶剂提取法。8、溶剂提取法有浸渍法、渗源法、煎煮法、回流提取法、连续提取等。分离纯化方法有，系统溶剂分离法、两相溶剂举取法、沉淀法、盐析法、透析法、结晶法、分馏法等。 从目标物中萃取有效成分，当恢复到常压常温时，溶解在流体中成分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开。萃取过程一般分为流体压缩→萃取→ 减压→分离四个阶段。

H. 如何检测原生质体的生物活性

由于原生质体没有细胞壁。那么不能用质壁分离的方法来检测。
可用荧光染料来检测，不能自由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。（细胞膜有选择透性）

I. 生物活性物质常用的分析方法有哪些

生物活性物质，是指来自生物体内的对生命现象具体做法有影响的微量或少量物质。
这种物质的检测只能依靠医学检验相关的分析方法。

J. 杀虫剂的常规活体生物测定有哪几种

杀虫剂的常规活体生物测定技术是在长期的杀虫剂筛选过程中发展起来的技术。有些经典的方法和配套的设备在现在的应用中仍然占有相当重要的地位。现将各类方法介绍如下：

（1）触杀作用（contactaction）。由于许多杀虫剂都具有触杀活性，因此，这方面的毒力测定方法及仪器很多。常用的方法有喷雾法、喷粉法、浸液法、点滴法、药膜法。

①喷雾法：喷雾法及喷粉法都是基于模拟田间实际防治时的施药情况，尽量使昆虫体表获得的药剂剂量相同且均匀。现在主要的试验用喷雾仪器有Hoskings横筒喷雾器、Campbeil转盘式喷雾器、沉淀降雾装置、Potter喷雾塔。

②喷粉法：喷粉法与喷雾法目的大致相同。此方法的优点在于喷洒不仅均匀，同时不只局限于上表面，而可使被喷的对象各个表面均可喷到。

③浸液法：浸渍法使用的对象一般是水生昆虫（如蚊子幼虫、水蚤）、储粮害虫、介壳虫及蚜虫、供试昆虫的卵。对蚊子幼虫，可做长时间的浸液接触处理，即直接浸于一定浓度的药液中，一定时间后观察结果。其他的陆生昆虫时间较短，一般几秒钟到几分钟不等。

④点滴法：其原理是将一定剂量的药剂滴在昆虫体壁上，以观察药剂对穿透昆虫体壁的触杀毒力。此方法是杀虫毒力测试中最精确的方法，也是目前普遍采用的一种测试技术，大多数的目标昆虫及螨类都可以运用。

在滴加药液前一般要先将昆虫麻醉，以免因为昆虫的自身运动影响实验操作准确性。麻醉的一般方法有冷冻法、乙醚处理法、二氧化碳处理法。另外，还需要注意昆虫的握拿方法，尽量不对供试昆虫造成机械伤害，对体型较大的昆虫可以用手拿，对较小的昆虫可以将昆虫吸在吸管管口上加药，在管口上加上细纱布效果更好。

⑤注射法：该法的使用也相当广泛，且使用仪器与点滴法有所类似，也有施药量精确的特点。只不过注射法是将药剂注入供试昆虫的体内，而非点滴在体表。

⑥药膜法：该方法是一种接触处理方法。原理是通过喷雾、喷粉、点滴、涂抹、浸液等方法，将一定量的药剂均施于滤纸、玻璃板或蜡纸上，形成一个均匀的药膜，再将供试昆虫放在上面，爬行一定的时间，然后再转移到正常的环境下，一定的时间后观察记录昆虫死亡情况。

此法适用于一切爬行的昆虫，也可用于某些飞翔的昆虫（如蚊、蝇等成虫），可以制作一个方形的玻璃盒，盒的6个面的内部都经过药膜处理，使得无论昆虫停息在哪里，都一样接触到药剂。另外，药膜放置不同时间后，或经过风化或日晒等处理后，再放入供试昆虫，可以测定药剂的持效性。

（2）胃毒作用（stomachaction）。其原理是利用昆虫的贪食性，在昆虫取食正常食物的同时将药剂食入，检测药剂是否能通过昆虫的消化道对昆虫产生毒力。一般方法有饲喂法、饲饮法、口腔注射法。

①饲喂法：饲喂的方法又分为无限制给食法及定量给食法。根据饲喂的方式又分为叶片夹毒法及单叶饲喂法。其中叶片夹毒法（sandwichmethod）最为常用。叶片夹毒法是在两叶片中间均匀的加入一定量的药剂，饲喂昆虫，药剂随叶片一起被昆虫食入，根据被吞食的叶片面积计算吞食的药量。为使加在叶片上的药剂量均匀，通常在一张叶片的一面通过喷粉、喷雾、涂布或滴加药剂等方法予以施药。待药液干后，将另一张叶片的一面涂抹浆糊或明胶后相互黏连，投喂昆虫。其优点是避免了药剂与虫体的直接接触，排除了药剂对昆虫的触杀作用。

吞食药量的计算是以试虫吞食叶面积乘以单位面积叶片的剂量，从而求得每头试虫单位体积中所取食的剂量（μg/g）。叶面积的计算有几种方法：1）方格纸法：将试虫吞食剩余的叶片放在方格纸上，计算所食方格纸的数量，算出方格的面积，2）叶面积测定仪法：采用叶面积测定仪直接测定吞食的叶面积；3）电脑扫描法：用数码相机摄下每个处理中试虫吞食后剩余的叶片，通过电脑计算出叶面积。

致死中量的求法是按每头虫吞食剂量的大小顺序排列，并标明该剂量下试虫的死活情况，从而将虫划分成生存组、生死组和死亡组。

1～8号为生存组，9～40号为生死组，41～47号为死亡组。生死组中既有生存的又有死亡的，分别计算生死组中生存个体和死亡个体平均吞食的药量，记为A和B。即A=（生死组活虫剂量总和）/生死组活虫总数，B=（生死组死虫剂量总和）/生死组死虫总数，LD50=（A＋B）/2。

杀虫剂对某种昆虫的食药量反应示范

A=（0.21＋0.23＋0.28＋……＋0.64）/16=6.00/16=0.375

B=（0.20＋0.22＋0.25＋……）＋0.65/17=5.89/17=0.368

LD50=（A＋B）/2=（0.375＋0.368）/2=0.372（μg/g）

该法的缺点是无限制饲喂法无法控制单一供试昆虫的取食量，定量给食法也不能排除昆虫吞食后呕吐行为等未知因素的影响，且计算昆虫食用叶片面积的方法不是十分精确，从而影响所食药剂的剂量。另外，也比较费事、费时，这种方法只适用于咀嚼式口器的昆虫。

饲喂法中，除了饲喂叶片外，还有饲喂毒饵等方法。

②饲饮法：此法适用蝇类、蝽类等有吸食习性的昆虫。也分为自由饲饮法和强制饲饮法。自由饲饮法是一种无限制的饲饮方法，让昆虫自己取食配好的混有药剂的糖液，通过测定吸食前后昆虫的重量或药液的体积计算昆虫吸食药剂的量。而强制性饲饮法就是将昆虫固定后，将装有药液的移液管口放在昆虫的口边，昆虫吸食到一定的体积后就移开移液管，这样可以保证每头虫体吸取药剂的量相同。另外，还有一种口腔注射法，该方法是将含糖的药液直接用注射器注入昆虫口腔内，强迫其吞食。一般要求针尖光滑，以免刺破口腔内的组织，并且要求操作技术熟练。

（3）熏蒸作用（fumigationaction）。熏蒸剂可以是气体，也可以是液体或固体，但最终都要以气态的形式通过昆虫的呼吸系统起到毒杀作用。气体易扩散的性质决定了熏蒸剂必须在密闭的环境下使用的特点。因此，药剂的熏蒸作用的检测也必须在密闭的条件下进行，并且要求不能以固态或液态的状态与昆虫直接接触。所有的熏蒸作用测定的方法都是基于该点来设计的。

目前熏蒸剂的仪器装置主要有静止气体的测定方法装置、有气流出入控制的熏蒸器。一般一些简单的熏蒸器都属于前一种，通过一定的方法使密闭的容器内充入饱和的气体，通过控制放入供试昆虫的时间来控制对充入气体的吸收量或调节容器内气体的浓度，达到控制剂量的目的。

另外，对土壤熏蒸剂在设计实验方法时还应考虑到土壤的物理及化学性质上的调节等问题。

（4）内吸作用（systemicaction）。内吸作用的基本原理是将药剂通过处理植物的某一特定部位（根、茎、叶或种子）后，药剂能被植物吸收，并通过传导，到达其他部位，让昆虫取食未直接用药的部位后观察昆虫是否中毒死亡，以判定药剂是否具此特性。

据此原理处理方法通常被称作直接测定法。不同的施药部位，处理的方法也有所不同。如果是从根部吸收的处理方法，可将植物主根顶端切除，留存部分插入盛药液的小指形管内，保存侧根浸入营养液中，或将营养液中加入药液配成所需的浓度，主侧根全浸在其中；如果从叶部施药，可用滴灌或毛笔蘸药涂抹甚至局部喷雾的方法将药剂施于叶片的正面或正反两面；如果是从茎部施药，木本植物可在茎部包扎一圈具有一定浓度药剂的脱脂棉，外部再以塑料布缠绕后包扎，如果植物较幼嫩可用涂抹的方法将药液涂在茎上，老树则需要将老树皮刮去一层后施药；如果试验种子的内吸作用，一般可将种子用浸液的方法处理，药液一般相当于种子重量的两倍，或以浸泡时完全淹没种子为度。

另一种被称为间接测定法，用药液处理植物的局部，一定时间后取未处理的部位加以研磨，稀释成不同浓度的汁液，再放入一定数量的孑孓或水蚤观察其死亡情况，利用此浸液法间接测定该药剂是否有内吸作用。

（5）拒食作用。拒食作用的设计方法通常跟胃毒作用的方法相同。但是观察的结果通常不是供试昆虫的死亡率，而往往是昆虫的取食量或是昆虫对食物的所食部位和昆虫体重的变化等做的分析，作为药剂对供试昆虫是否有拒食活性的依据。

一般对食叶咀嚼式口器昆虫的拒食活性的测定方法为叶碟法。即将药剂均匀施加在叶片上，制成大小相同的叶碟，放在保湿的培养皿中，后放入供试昆虫。其中在同一培养皿中交错放入处理叶碟与对照叶碟的方法叫做选择性拒食活性测定法。仅放入对照或处理叶碟的方法叫非选择拒食活性测定法。如，黑色圆圈表示加药的叶片，白色圆圈表示未加药的叶片。A表示选择拒食活性的测定，B、C表示非选择拒食活性的测定。让供试昆虫取食一定时间后，将残存的叶片取出，算出昆虫取食叶片的面积。通过公式计算出拒食率：

叶碟法

（6）引诱作用。引诱剂基本上可分为性引诱剂、食物引诱剂和产卵引诱剂。

粗略的测定方法可以通过设置诱惑陷阱。如在纱笼中放入一个有黏胶的架子，黏胶中央黏上滴有药剂的棉花，引诱目的昆虫。对体型较大的昆虫，可以将黏胶换成毒气瓶，通过计算诱集昆虫的数量，判断药剂的有效率。

这些方法多数是在田间操作的，易受气候因素及田间昆虫数量多少的影响。在实验室测定的方法中很多要用到嗅觉计。基本原理是让昆虫在两个可选择的道路的分叉处，这两个道路一个支路放有待测药剂，另一个则没有。观察昆虫进入哪一个支路。如果药剂没有作用，则昆虫进入两条支路的几率是相等的，而一旦引诱剂有作用，作用越强，昆虫被引诱的数量越多。

（7）驱避作用。其原理与引诱剂的原理类似，在试验设计时也可以用到嗅觉计，方法大致相似。

（8）生长发育与生育干扰作用。有此性质的化合物通常不直接杀死昆虫，而是通过干扰昆虫脑激素、保幼激素、蜕皮激素和几丁质的合成导致昆虫生长、变态、滞育等生理现象发生改变，间接导致为害降低的目的。试验方法可以通过以上介绍的胃毒、接触、熏蒸、内吸等处理方法，观察昆虫蜕皮、化蛹、羽化的变化及其形态的变化、产卵量及卵的孵化率等指标来观察药剂作用的效果。