在实验室如何准备微生物培养工作

1. 微生物的实验室培养（高中生物）

奇怪，高中生物我以前怎么没学这些。还好我是研究微生物方向的。我就一字字打给你吧，希望你有用没用看它个50%以上吧，别让我白忙就行。以下回答绝对权威，表述有些未采用专用术语。

针对你所问的三个大范围的问题，我只能简单的介绍一下。
1、培养基就是微生物生长繁殖的物质和环境基础，培养基含有氮源，碳源，水，生长因子等等。可以分成固体培养基，液体培养基，天然培养基，合成培养基，选择培养基等等。不同培养基的功能不同，有的是活化微生物用的，有的是选择微生物用的，有的则是保藏微生物用的。根据具体的目的和微生物的种类，选择不同的培养基。而且选择的培养基所用的营养成分的比例根据具体需要而定。至于保藏的方法，有短时保藏，也有长时间冻藏的，保藏方法也有很多，你所说的临时保藏就是斜面试管4摄氏度保藏法，它是将微生物划线于斜面试管培养基上，而后4摄氏度低温保藏。是需要培养基的。甘油保藏法也有几种不同的操作方法，有的是【无菌水+细菌】和甘油以不同比例混合成10%-40%不等的甘油浓度保藏液，有的则是【培养基（液体培养基）+细菌】和甘油按比例混合成10%-40%不等的甘油保藏液，而后于-20摄氏度条件下冻藏，保藏期通常数年。所以也是需要培养基的。这也是众多培养基中的一小部分而已。第一个问题先告一段落吧。
2、有点晕，第二个问题更复杂。你所说的稀释涂布平板法主要是用于细菌的分离和纯化步骤上，由于菌悬液浓度过高时，接种于培养基上会出现密密麻麻的菌落，菌落之间相互重叠，也就失去了分离纯化的意义。菌悬液浓度太低的话可能你涂布到平板上的菌悬液中没有了你需要的细菌。也无法分离出目的细菌。
对于你说的一步到位，是多少浓度合适呢？你不知道，所以就只能10倍，100倍，1000倍，10000倍的稀释下去，然后每个浓度的菌悬液都涂布相应的平板，这样，就可以保证会有一种浓度比较合适，能够分离纯化出你要的细菌。当然了，如果你一次性稀释的恰到好处，也是可以的，能分离到纯的单菌落没人敢否认你，不过就是这样的成功率不高，或者说很难。这种方法也是挺麻烦的，不过稀释也是很简单的操作。不知道这样说你能否明白？
3、第三个问题稍微好叙述些。原理：单纯的水在-20摄氏度会结成冰晶，破坏细胞壁和细胞膜，使细菌死亡。甘油则不会形成冰晶，可以保持细胞壁和细胞膜的完整性。同时由于100%的甘油不能将细菌均匀混合，太黏了也不太会流动，所以要稀释成10%-40%浓度的甘油，我们实验室一般使用20%终浓度的甘油进行保种，注意是终浓度20%，不是浓度为20%。如果浓度低于15%或10%，同样会有冰晶，会破坏细胞壁和膜。另一个面，细菌毕竟是细菌，不是高等生物，它们的抗逆性很强，-20摄氏度不会杀死它们，只是抑制了它们的活性，因而它们停止了生长，进入一种类似休眠的状态，但条件合适时，它们会继续繁殖。当然经过甘油-20摄氏度低温保藏的菌种在使用之前是要经过活化的，注意了，这就是我前面所说的活化培养基，它是一种营养环境，目的是让处于休眠的细菌醒过来，恢复活力。这再另一方面回答了你培养基有什么用的问题。它还有活化细菌的作用。别说-20摄氏度不会冻死细菌，有些细菌在100度的温度下都能存活的，当然这样的细菌是嗜极细菌就是了。

说了这么多，也不知道你有没认真看完，是否看明白了。别让我辛辛苦苦打这么多字你就随便瞄几眼。～～～～还有就是如果看明白了，也希望你把分给我吧，最近问了些基因克隆方面的问题，分用了不少，所以现在正在挣分数。。。谢谢。

2. 微生物的培养方法

1．平板划线分离培养法

对混有多种细菌，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。平板划线分离法通常有两种方法：

①分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的¼）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。

②连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。

2.琼脂斜面接种法

主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

3．穿刺接种法

此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。

4．液体培养基接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。

5．倾注平板法

本法主要用于饮水、饮料、牛乳等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。

全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2

每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数

6．涂布接种法

本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

3. 微生物如何培养

给你说说很简单的微生物培养吧。我们天天吃的馒头就是微生物培养出来的，一般使用糯米煮成米饭，加入酒酿或者干酵母，就可以成为酒醪了，酒醪的稀释液拌面粉，就能够做成馒头了。

4. 微生物培养方法

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。

5. 微生物的实验室培养（高中生物）

1、培养基为微生物提供生长、发育、繁殖所需的碳源、氮源等。微生物才能正常生存、繁殖，为科学实验所用。保存是有一定的条件的，避免微生物发生变异，这时不利于研究了，所以要有特定的方法。保存的方法有：1、石蜡油低温保藏；2、甘油冷冻保藏（常用）；3、真空冷冻干燥；4、液氮超低温保藏等方法。都是为了更好的保存和保持菌种。
2、原因有两个：1、获取单一种类的目的微生物；2、能够看到由一个微生物繁殖形成的菌落。因为最后一步是要看到肉眼可见的菌落，不同的微生物生活在不同的场所，条件不同，数量也不相同，为了能够分散开来，形成由一个微生物繁殖形成的菌落，看哪一个梯度最适宜。科学家已经做也了个大概，就必须要进行梯度稀释。这也就是不能一步到位的原因，要进行实验，，不同的微生物就要不同的梯度，我们才最容易看到由一个微生物繁殖形成的菌落。这样就必须把每个稀释度的都要涂到培养基上。
3、甘油保存菌种的条件是需要冻存。主要靠低温来降低微生物活性，达到保存的目的。加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞。
它的适用范围广，操作简便、效果好。最重要的是无变异现象发生。

6. 微生物培养需要什么条件

微生物的实验室培养：
营养构成：
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
无菌技术：
(1)关键：防止外来杂菌的入侵。
(2)具体操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(3)消毒和灭菌
制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
接种方法：
平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。

7. 如何培养微生物

实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒
实验二 土壤中微生物分离纯化培养
实验三 菌种保藏
实验四 细菌形态观察及单染色
实验五 放线菌及霉菌形态观察
实验六 革兰氏染色及芽孢染色
实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定
实验八 微生物直接计数法及测微技术
实验九 大肠杆菌生长曲线的测定
实验十 水中细菌总数的测定
实验十一细菌细胞的生化反应实验
实验十二噬菌体的分离、纯化及效价测定

实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒

一、实验目的
了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。

二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

三、试剂与器材
1.器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2.试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂

四、实验内容
1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查
2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物
3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查
4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌
五、关键步骤及注意事项
1.要严格按配方配制。
2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。
4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。

实验二 土壤中微生物分离纯化培养

一、实验目的
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。

二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。
三、试剂与器材
1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。
2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基

四、实验内容
1.土壤稀释液的制备
2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术

五、关键步骤及注意事项
1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。
2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。
实验三 菌种保藏
一、实验目的
1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。
2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。

二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法

三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2.试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3.器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。

四、实验内容
1.斜面保藏法
2.液体石蜡法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷冻真空干燥保存法

五、关键步骤及注意事项
1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。
2.熔封安瓶时防止封闭不严。
3.液氮冻存操作应防止冻伤。

实验四 细菌形态观察及单染色

一、实验目的
1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。
4.初步认识细菌的形态特征。

二、实验原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。

三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
2.试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。
3.器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。

四、实验内容
简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。

实验五 放线菌及霉菌形态观察

一、实验目的
1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。
2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。
3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。

二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

三、试剂与器材
1.材料 黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。
2.实验器材 经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。

四、实验内容
倒平板→接种→插片→培养→镜检

五、关键步骤及注意事项
1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。
2.插片时要有一定角度并与划线垂直。
3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。
4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
实验六 革兰氏染色及芽孢染色
一、实验目的
1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
4.学习显微镜(油镜)的使用方法。
5.初步认识细菌的形态特征。

二、实验原理
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

三、试剂与器材
1.材料：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
2.试剂 革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液)。5％孔雀绿水溶液
3.实验器材 小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。

四、实验内容
1.革兰氏染色法 制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检。
2.Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检。

五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。

实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定

一、实验目的
1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。
2.学习鉴别死活细胞的实验方法。

二、实验原理
酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

三、试剂与器材
1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2.试剂 0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。
3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。

四、实验内容
1.美蓝浸片观察 酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检
2.水-碘浸片观察

五、关键步骤及注意事项
1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。
2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。

实验八 微生物直接计数法及测微技术

一、实验目的
1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。
2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。

二、实验原理
显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：
lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个)
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
三、试剂与器材
1.材料 酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2.实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。

四、实验内容
1.微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板
2.微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定

五、关键步骤及注意事项
1.防止加样空气泡产生。
2.调节显微镜光线的强弱适当。
实验九 大肠杆菌生长曲线的测定

一、实验目的
1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。
2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

二、实验原理
将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。

三、试剂与器材
1.材料与试剂 大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管(5ml／支)、剩余60ml装入250ml的三角瓶。
2.器材 722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。

四、实验内容
编号→接种→培养→比浊测定

五、关键步骤及注意事项
1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定
2.严格控制培养时间

实验十 水中细菌总数的测定

一、实验目的
1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2.了解水源水的平板菌落计数的原理。

二、实验原理
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

三、试剂与器材
1.试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水
2.器材 灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

四、实验内容
1.水样的采取
2.细菌总数测定
3.菌落计数方法

五、关键步骤及注意事项
1.注意全过程防止染菌
实验十一 细菌细胞的生化反应实验

一、实验目的
了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法。

二、实验原理
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH5．2为黄色，pH6．8为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证．

三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、普通变性杆菌、产气杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。
2.试剂甲基红试剂、40％KOH、5％a一萘酚、乙醚、吲哚试剂。
3.实验器材德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱。

四、实验内容
培养基配制→编号→试管→接种→培养→观察结果

五、关键步骤及注意事项
1.要严格按照培养基配方配制培养基。
2.观察结果时要注意滴加药量及反应时间。
实验十二 噬菌体的分离、纯化及效价测定

一、实验目的
1.学习分离、纯化噬菌体的原理和方法
2.观察噬菌斑的形态和大小
3.掌握噬菌体效价测定的基本方法

二、实验原理
噬菌体是细菌的专性寄生物，自然界中凡是有细菌存在的地方，均可以发现其特异性的噬菌体，噬菌体侵入细菌细胞后，利用宿主细胞的酶系统进行复制和增殖，最终导致细菌细胞裂解，噬菌体从细胞中释放出来，可以进一步侵染细菌细胞。在液体培养基中，噬菌体可以使浑浊的菌悬液变为澄清。在长有宿主细菌的固体培养基平板上，噬菌体可以裂解细菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此可以利用这个性质对噬菌体进行分离和效价的测定。
噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，即一毫升培养液中所含有的噬菌体数量。噬菌体效价的测定方法多采用双层琼脂平板法。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。

三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含有琼脂0．5％，试管分装，每管3～5m1)、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基。
2.器材培养皿、无菌吸管、三角瓶、抽滤瓶、蔡氏细菌滤器、真空泵、阴沟污水。

四、实验内容
噬菌体分离→噬菌体纯化→效价测定

五、关键步骤及注意事项
1.噬菌体时要注意细菌滤器的型号。
2.纯化噬菌体时要注意形态、大小。
3.效价测定时要注意双层琼脂平板法的使用技巧。

8. 在实验室,以及在大规模的微生物工业生产中,如何培养微生物

实验室采用恒温培养箱和摇床等实验设备培养，工业上在实验种的基础上，再采取多级扩大培养的方式，比如从摇瓶种接到立方级别的的种子罐，根据生产需要可以采取多级种扩大的工艺。

9. 如何进行微生物的培养

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：
①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;
②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;
③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。

10. 微生物实验室的基本要求

1微生物实验室基本要求:
①准备室：
准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。
②灭菌室：
灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。

④洗涤室：
洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，zui-好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。