如何对微生物进行选择性分离

‘壹’ 分离纯化微生物的方法有哪些各方法适用分离什么菌种

主要有：划线法、倒平板法、涂布法，根据分离的菌种选择不同的培养基。

稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离。

分离技术

主要是稀释和选择培养，稀释是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线法。

如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。为保证分离到的微生物是纯培养，分离时必须用。

以上内容参考：网络-微生物分离纯化

‘贰’ 微生物纯种分离的方法有哪些

自然界中的微生物总是杂居在一起 即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物 要研究其中某一种微生物 首先必须将它分离出来 下面介绍几种纯种微生物的分离方法
平板划线分离 将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板 用接种环沾取少量待分离的材料 在培养基表面平行或分区划线（图5-5）然后 将培养皿放入恒温箱里培养 在线的开始部分 微生物往往连在一起生长 随着线的延伸 菌数逐渐减少 最后可能形成纯种的单个菌落
液体稀释法 将待分离的样品经过大量稀释后 取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面 培养后就可能得到单个菌落
利用选择培养基进行分离 不同的微生物对不同的试剂 染料 抗生素等具有不同的抵抗能力 利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基 用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的
菌丝尖端切割 这种方法适于丝状真菌 用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端 将它们移到合适的培养基上培养后 就能得到新菌落

‘叁’ 从自然界分离筛选微生物菌种的基本程序包括哪些

⑴采样:从适合微生物生长的环境采样
⑵富增:根据其特性选择性的富集目的微生物
;⑶初筛:采用平板对富集的目的微生物纯种分离,确定其活性选出高产菌种,一般200株;
⑷复筛:对第一次分离的微生物菌种,再次筛选,一般40株;
⑸二级复筛:从40株选出5株⑹确定菌种,进行生产性能测定.

‘肆’ 选择性分离微生物育种的步骤大致有哪些

一、微生物工业对菌种的要求

(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;

（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;

（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;

（4）能够高效地将原理转化为产品;

（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;

（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;

（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;

（8）具有抗噬菌体的能力；

（9）遗传稳定性，

二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；

（2）从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

（二）微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程

（1）新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下：

标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏

①采样

采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

②标本预处理

④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。

⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，

⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。

2、菌种的分离方法

（1）施加选择性压力分离法

主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

（2）随机分离方法

有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。

A、抗生素产生菌的分离

抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。

Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离

抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。

B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

Ｃ、生长因子产生菌的分离

以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中。

‘伍’ 如何将特殊目的之微生物筛选出来并将这些微生物如何应用于工业加以叙述

如何将特殊目的之微生物筛选出来
微生物产生菌的分离筛选 微生物的分离
经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。
一、好气微生物的分离
分离的方法很多，大体可分为两类：一类较为粗放，只能达到“菌落纯”，如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等。前两种方法由于操作简便有效，工业生产中应用较多。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操作装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。下面对这几种分离纯化方法分别加以介绍。
（一） 稀释涂布法
把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等，样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。
（二） 划线分离法
用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。
在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的情况下，微生物的纯种分离方法可以简化如下：第一种方法，取一支盛有3～5ml无菌水的粗试管或小三角瓶，取混匀的样品少许（0.5g左右）放入其中，充分振荡分散，用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培养，或者用接种环接一环于平板上划线培养。这种方法不需要菌落计数，比以上常规稀释法简便。第二种方法，取风干粉末状的土样少许（几十毫克）直接洒在选择性分离培养基平板上或混入培养基中制成平板，置适温培养一定时间，长出菌落。例如分离小单孢菌就可采用该方法，从河泥中取样，风干研碎，取样品粉末20～50mg直接加到天门冬酰胺培养基中，混合均匀制成平板，培养后长出鱼卵状菌落。这种方法有时分离不够充分，可用划线法进一步纯化。

‘陆’ 如何进行生产菌的分离和筛选

（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。 菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株，为使筛选达到事半功倍的效果，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选，如从酱油中分离蛋白酶产生菌：
（1）向菌种保藏索取有关的菌株，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
在实验工作中工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株、分离、产物鉴别几个步骤

‘柒’ 自然界分离微生物的一般操作步骤是什么

先确定要分离的微生物的种类
然后选取合适的选择性培养基
然后接种，可以用直线，也可以用曲线法，然后在适合条件下培养，
重复几次直至得到纯的菌落