微生物实验要注意哪些

① 做微生物实验要注意什么

呵呵 我也是学这个专业的
从一开始的时候，老师就强调我们
微生物的实验最怕什么。就是最怕微生物 会沾染杂菌
而且 除了你要培养的微生物的安全之外你还要考虑好自身的安全以及环境安全

进实验室之前一定要穿实验服，如果有条件的可以经常给实验服灭灭菌，带手套是一定要的，还有口罩，一般活性炭口罩就可以了。必要时要带脚套和帽子，如果需要接触有毒物质，最好在乳胶手套外面再增加一个一次性的塑料手套，透明的那种，可以随时扔掉

关于你自己的东西可以紫外线杀菌，然后操作之前要用无水乙醇有的说是医用酒精，浓度百分之七十五的擦拭双手，所有动作要在超净台中进行。

实验器具也要灭菌，一般不太讲究的就是干热灭菌和高压蒸汽灭菌，一般培养基什么的都是高压蒸汽灭菌。以前专业课老师讲过，高压蒸汽灭菌的话效果比干热灭菌要好，因为受热均匀灭的比较透彻。蒸汽灭菌锅我就不多说了吧，楼主应该会用。

其他的东西 比如平皿什么的就用干热灭菌，在烘箱里面，一般用报纸裹好，至于你常用的枪头和枪的话同样也要灭菌。
如果要求严格的话所有的器皿我指的是玻璃的，要先刷洗干净后泡在铬酸洗液当中，要求过夜，完后拿出来控干，差不多不滴水就行，用少量自来水洗去带颜色的那部分铬酸，这一部分的水是要求倒入废液瓶中，不可以进入下水道的。然后用自来水洗四十遍，其实要求是四十到五十遍，没错，我没有打错，你也没有看错，就是要这么多遍。然后，蒸馏水润洗三遍，晾干就可以进行干热灭菌了。瓶盖瓶塞之类的要在盐酸当中过夜，1%的，然后自来水洗蒸馏水洗涤就好。
有棉塞什么的东西记得要在酒精的的外焰上过一下，接种针要灼烧到发红在晾凉！
培养的过程要看你是连续培养还是半连续的还是不连续的，在加培养液的时候同样注意不要引入杂菌
记住，在实验室里坚决不允许吃东西喝水！
出来的时候要记得洗手哈，实验服别随便乱扔
至于废料肯定不能带出来滴，那些有毒的或者生长非常快的微生物沾染过的不要随便的就扔掉要放在废物桶里统一处理，培养皿清洗干净后，再次干热灭菌就又可以用了哈
然后差不多粗浅的说一下吧，具体的如果你需要更详细的资料的话应该书上应该有更详细的。

这个问题貌似刚刚回答过一次了，那我就直接把我回答过的答案又复制过来了，这个可不涉及到那种能搜一搜到的啊，可是我一个字一个字的敲上去的，楼主看着办吧

② 用显微镜观察微生物时需注意哪些问题

1、持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。

2、放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。

3、要养成两眼同时睁开观察的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。

4、水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即用擦镜纸擦净。

5、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘10cm处，以免碰翻落地。

6、保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。

7、不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。

8、使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。

③ 微生物检测手段及注意事项

1. 微生物计量法

1.1 体积测量法

又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液(如10 mL)放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm)，离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

1.2称 干重法

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3 比浊法

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。

1.4 菌丝长度测量法

对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

2. 微生物计数法

2.1 血球计数板法

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2 染色计数法

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

2.3 比例计数法

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4 液体稀释法

对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN(Most Probable Number)得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5 平板菌落计数法

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的'细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

2.6 试剂纸

在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7 膜过滤法

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

3. 间接测定法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。

3.1 测定含氮量

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

3.2 测定含碳量

将少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

3.3还原糖测定法

还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

3.4 氨基氮的测定

离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。

3.5 其他生理物质的测定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸，产气，产CO2(用标记葡萄糖做基质)，耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。

4. 商业化快速微生物检测法

微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：

4.1 试剂盒，培养基等手段

抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。

4.2 借助新型先进仪器

BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(Impedance Technology)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管(根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管)，然后每个点取一管出来测OD值就行了。

一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区(200 nm～400 nm为紫外光区，400 nm～800 nm为可见光区)。空白如用水做，需要离心洗涤菌体;空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显着降低。

一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。

另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm

这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。

④ 微生物实验中无菌操作应注意什么

环境，人员，器具
环境的话主要靠超净台，操作过程要靠近酒精灯
人员的话，实验操作者一定要注意消毒，操作过程要小心
器具则是实验过程中用到的东西一定都要事先灭过菌，不能高温灭菌的应用紫外灭菌，直接接触微生物的，在进行操作之前还行通过酒精棉和酒精灯再次消毒。

⑤ 实验室微生物检验需要注意哪些问题

微生物检验无菌操作的注意事项有很多细节，日常的微生物检验过程中要注意无菌操作，除了要在洁净台和操作器皿上的消毒，还需要注意人员卫生和环境的卫生。

【操作技巧】

进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。

【培养前准备】

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后.囚物品不全往返拿取而增加污染机会。

【火焰消毒】

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

【洗手和着装】

原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【操作台消毒】

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而.为在一切操作中为最大可能的保证无菌.每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置.否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

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⑥ 微生物检测应注意什么事项

1、工作室要矮小平整、光滑、无凹凸不平或棱角、四壁及屋顶用不透水之材质，便于擦洗及杀菌。

2、室内采光面积应大，从室外应能看到室内的情况。

3、为保证无菌室的洁净，无菌室周围需设缓冲走廊，走廊旁再设缓冲间，其面积可小于无菌室。

4、无菌室、缓冲走廊及缓冲间均设有日光灯及紫外灯，杀菌紫外灯离工作台以一米为宜，其电源开关应设在室外。

5、无菌室与缓冲间进出口应设推拉门，门与窗平齐，门缝要封紧，两门要错开，以免空气对流造成污染。

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