工业生产上常用的微生物培养技术有哪些

1. 微生物分离和纯培养技术有哪些

微生物的培养方式
1．分批培养（batchculture）将微生物置于一定容积的培养基中，经培养，最后一次收获，谓分批培养。在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，不再更换。由于营养消耗，代谢产物积累，对数生长期不能长期维持。
2．连续培养（continuous culture）在培养器中不断补充新鲜营养物质，并不断排出部分培养物（包括菌体和代谢产物），以保持长时间生长状态的一种培养方式。主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两类。恒浊连续培养通过不断调节流速，使培养液浊度保持恒定，因而可不断提供具有一定生理状态的细胞，并可得到以最高生长速率进行生长的培养物。恒化连续培养通过控制恒定的流速使营养物浓度基本恒定，从而使微生物保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制性营养物进行恒化培养，可得到不同生长速率的培养物。
3．半连续培养（semi-continuous culture）在发酵罐中的一部分发酵液保留下来作为菌种液，放出其余部分进入提练加工工序，在剩余的培养液中加满新的未接种的培养液，继续培养，如此反复，谓之半连续培养。
4．补料分批培养（fed-batch culture）补料分批培养又称半分批培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养液，但不取出培养物。待培养到适当时期，将其从反应器中放出，从中提取目的生成物（菌体或代谢产物）。若放出大部分培养物后，继续进行补料培养，如此反复进行，则称为重复补料分批培养（repeated fed-batch culture）。与传统分批发酵相比，补料分批发酵的优点在于使发酵系统中的基质浓度维持在低水平，这有以下优点：①可除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，以减轻供氧矛盾；②避免有毒代谢物的抑菌作用；③大为减少了无菌操作要求十分严格的接种的次数。与连续发酵相比，补料分批培养不会产生菌种老化和变异等问题。故其应用范围十分广泛。
5．同步培养 能使培养的微生物处于较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法。利用同步培养法控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长（图3—4）。用同步培养法得到的培养物叫同步培养物（synchronous culture）。这样，群体和个体行为一致，即可用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。由于同步群体的个体差异，同步生长往往最多维持2个～3个世代，然后又逐步变为随机生长。

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2. 微生物的培养技术及应用有哪些

微生物的培养技术及应用有好氧培养和厌氧培养。

应用是不断发现和广泛应用各种抗生素，对细菌细胞和病毒形态的研究已经达到亚显微结构的水平，从而进一步理解它们的活动规律，进一步阐明了细菌内、外毒素的性质、组成和作用机理，显着地改进了分离培养技术，大大提高了从病人标本中分离弯曲菌或类杆菌的阳性率。

好氧培养也称好气培养。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

微生物培养技术

厌氧培养也称厌气培养。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。研制开发免疫原性好，副作用小的新型微生物，研制特异，灵敏，简便，快速的微生物学诊断方法及技术。

3. 微生物接种技术有哪些

七、涂布接种

先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

4. 微生物培养技术常用哪些设备，功能如何

这也太多了，怎么也得上百种吧。
主要有：超净工作台、恒温培养箱、厌氧培养箱、冰箱和低温冰箱、高压灭菌锅、生物安全柜、摇床、显微镜、恒温水浴锅、恒温干燥箱、酸度计、分光光度计、马弗炉、高速组织捣碎机、多用途振荡器、标准筛、各种各样的玻璃仪器一大批、各种各样的生化试剂和化学制剂一大批。
反正一般的化学实验室、化学分析室中的仪器设备，在微生物培养中都能用到。

5. 工业发酵常用的微生物有哪些

工业生产上常用的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌,由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入,藻类、病毒等也正在逐步成为工业生产的微生物.
1．细菌 工业生产中常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌、节杆菌、假单胞菌、小球菌等,用于生产乳酸、醋酸、氨基酸、核苷酸、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、维生素、肌苷酸、丙酮丁醇等产品以及生物防治、细菌浸矿等.
2．放线菌 它的最大经济价值在于能产生多种抗生素.从微生物中发现的抗生素,有60%以上是放线菌产生的,如链霉素、金霉素、红霉素、庆大霉素等.常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等.近年来也用放线菌生产氨基酸、核苷酸、维生素和酶制剂等.
3．酵母菌 工业上常用的酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等,用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、生产酒精、脂肪酶,以及生产可食用、药用和饲用的酵母菌体蛋白等.
4． 霉菌 工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉、子囊菌纲的红曲霉,半知菌类的曲霉、木霉、青霉等；它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸、生长素及甾体激素等.

6. 微生物大规模工业生产常用的培养的方法有哪些

深层液体发酵搅拌罐； 固态发酵培养；

7. 微生物育种技术有哪些

其方法通常为自然选育和人工选育两类，可单独使用，也可交叉进行。
DNA Shuffling技术
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随着PCR技术的发展和应用，1994年美国的stemmer提出了一个全新的人工分子进化技术——DNA Shuffling（又称洗牌技术），该技术能模拟生物在数百年间发生的分子进化过程，并可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上万倍的功能性突变基因。其基本原理是将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化 产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一个基因拷贝的引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作新一轮的体外重组。一般通过2-3次循环，课获得产物大幅度提高的重组突变体。
2自然选育
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对自然界中的微生物，在未经人工诱变或杂交处理的情况下进行分离和纯化（见微生物的分离和纯化），然后进行纯培养和测定（见微生物测定法），择优选取微生物的菌种。这种方法简单易行，但获得优良菌种的几率小，一般难以满足生产的需要。
3人工选育
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分诱变育种和杂交育种两种。
诱变育种

以诱发基因突变为手段的微生物育种技术。1927年，H.J. 马勒发现X射线有增加突变率的效果；1944年，C.奥尔巴克首次发现氮芥子气的诱变效应；随后，人们陆续发现许多物理的（如紫外线、γ射线、快中子等）和化学的诱变因素。化学诱变因素分为3种：①诱变剂与一个或多个核酸碱基发生化学变化，使DNA复制时碱基置换而引起变异，如羟胺亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亚硝基甲基脲等；②诱变剂是天然碱基的结构类似物，在复制时参入DNA分子中引起变异，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤和2-氨基嘌呤等；③诱变剂在DNA分子上减少或增加1～2个碱基，使碱基突变点以下全部遗传密码的转录和翻译发生错误，从而导致码组移动突变体的出现，如吖啶类物质和一些氮芥衍生物（ICR）等。诱变育种操作简便，突变率高，突变谱广，它不仅能提高产量，改进质量，还可扩大产品品种和简化工艺条件。如1943年从自然界分离到的青霉素产生菌的效价只有20单位/毫升，经过一系列的诱变育种后，效价已达40000单位/毫升；金霉素产生菌经诱变后，发酵液中又积累了去甲基金霉素；谷氨酸棒杆菌1299经紫外线诱变后，有的能产赖氨酸，有的能产缬氨酸，增加了产品的种类；土霉素产生菌经诱变后，选到了能减少泡沫的突变菌株，从而提高了发酵罐的利用率。诱变育种的不足是缺乏定向性。
杂交育种

不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂种，或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂种或重组体或是它们的后代中筛选优良菌种。通过这种方法可以分离到具有新的基因组合的重组体，也可以选出由于具有杂种优势而生长旺盛、生物量多、适应性强以及某些酶活性提高的新品系。杂交育种的方式因实验菌株的生殖方式不同而异，如有性杂交、准性重组、原生质体融合、转化、转导、杂种质粒的转化等；但是，选择亲株、分离群体后代的培养、择优去劣和杂种遗传分析的过程基本是相同的。杂交法一般指有交配反应的菌株进行交配或接合而形成杂种。这种方法适用范围很广，在酒类、面包、药用和饲料酵母的育种，链霉菌和青霉菌抗生素产量的提高，曲霉的酶活性增强等方面均已获得成功。
体细胞融合是在不具性反应的品系或种属间细胞融合和染色体重组，先用酶溶解细胞壁，再用氯化钙-聚乙二醇处理原生质体，促使融合，获得杂种。此法在工业微生物的菌种改良中有积极作用。
转化和转导首先应用于细菌，现已广泛用于链霉菌和酵母菌等。随着重组DNA技术的发展，重组质粒的构建和转化系统的确立，已可将目的基因转移到受体细胞内，得到能产生具有重要经济价值的生物活性物质（如疫苗、酶等）的株系。
微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。此外，原生质体诱变技术已广泛地应用于酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素等的菌种选育中，并且取得了许多有重大应用意义的成果。
4诱变育种
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1.1物理诱变
1.1.1紫外照射
紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰在260nm，因此在260nm 的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。
紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。
1.1.2电离辐射
γ- 射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用,可直接或间接地改变DNA 结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖- 磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基，这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA 分缺失和损伤[2]。
除γ- 射线外的电离辐射还有X- 射线、β- 射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性，操作要求较高，且有一定的危险性，通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。
1.1.3离子注入
离子注入是20 世纪80 年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986 年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中逐渐引入该技术[3]。
离子注入时，生物分子吸收能量，并且引起复杂的物理和化学上的变化，这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由基，可以引起其它正常生物分子的损伤，可使细胞中的染色体突变，DNA 链断裂，也可使质粒DNA 造成断裂。由于离子注入射程具有可控性，随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能[4]。
离子注入法进行微生物诱变育种，一般实验室条件难以达到，目前应用相对较少。
1.1.4 激光
激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[5]。
激光作为一种育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来应用于微生物育种中取得不少进展。
1.1.5 微波
微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300MHz~300GHz，对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从而引起生理生化反应；非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应[6]。
因而,微波也被用于多个领域的诱变育种，如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。
1.1.6 航天育种
航天育种，也称空间诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间，利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异，再返回地面进行选育，培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力，空间辐射，以及其它诱变因素如交变磁场，超真空环境等，这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤，使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。
航天育种较其它育种方法特殊，是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高，成本高，个体研究者或一般研究单位都难以实现，只能与航天技术相结合，由国家来完成。
1.1.7 常压室温等离子体诱变育种
常压低温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma）简称为ARTP，指能够在大气压下产生温度在25-40 °C之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。ARTP技术作为一种新型的物理方法，在微生物诱变育种领域有着广阔的应用前景。
等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，菌株出现遗传物质损伤后，微生物启动SOS修复机制，其诱导产生DNA聚合酶Ⅳ和V，它们不具有3ˊ核酸外切酶校正功能，于是在DNA链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制仍能继续前进。在此情况下允许错配可增加存活的机会。ARTP对遗传物质造成的损伤，多样性较高；又SOS诱导修复本身为容错性修复，因此，ARTP多样性的损伤将可能在修复过程中包容于DNA链中，在微生物进行复制修复时，其可能带来多样性的错配可能。
ARTP应用于微生物突变育种，成本低、操作方便，没有很多物理诱变设备（如离子束注入等）所需的离子或电子加速、真空和制冷等附属设备；ARTP对遗传物质的损伤机制多样，具有较高的正突变率，突变性能多样，对于真菌、细菌、藻类等都有效果；ARTP对环境无污染，保证操作者的人身安全，无论用何种气体放电，其均无有害气体产生。[1]
5化学诱变
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2.1.1 烷化剂
烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应，引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异，常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate,EMS) 是最常用的烷化剂，诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。
N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍（NTG) 是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应该注意。在碱性条件下，NTG 会形成重氮甲烷（CH2N2），它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的[2]。
硫酸二乙酯（DMS) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。使用浓度0.0001%~0.1%，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。
2.1.2 碱基类似物
碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA 分子中导致DNA 复制时产生错配，mRNA 转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶（5- FU) 、5- 溴尿嘧啶（5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 对产色素菌（分枝杆菌T17- 2- 39） 细胞进行诱变，生物量平均提高22.5%.
2．1.3 无机化合物
诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化锂，白色结晶，使用时配成0.1%~0.5%的溶液，或者可以直接加到诱变固体培养基中，作用时间为30min～2d。亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成0.01~0.1mol/L 的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。
2.1.4 其他
盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C 上，使G- C 变为A- T。也较常用,使用浓度为0.1%～0.5%，作用时间60min～2h。
此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等[7]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株，经DMS 和NTG 多次诱变处理，获得一株L- 组氨酸产生菌。
2、诱变剂
2.1 诱变剂的选择
在选择诱变剂时，需要注意诱变剂的专一性，即某一诱变剂或诱变处理优先使基因组的某些部分发生突变而别的部分即使有也很少发生突变。对诱变剂专一性的分子基础不十分了解万尽管有关的修复途径必定对此有影响，但它们的关系并不那么简单，其它各种因素，包括诱变处理的环境条件也能影响突变类型。
工业遗传学家很难正确地预言改良某一菌种时需要何种类型的分子水平的突变。因此，为了产生类型尽可能多的突变体，最适当的方法是采用几种互补类型的诱变处理。远紫外无疑是所有诱变剂中最为合适的，似乎可以诱导所有已知的损伤类型。采取有效、安全的预防方法也很容易。在化学诱变剂中，液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作。的另一个不利因素是它有产生紧密连锁的突变丛的趋势，尽管这种效应在某些体系中能成为有利条件。最后，必须认识到可能某些特异菌系用某些诱变剂是不能被诱变的。当然这一点通过测定易检出的突变体，如抗药性突变体或原养型回复突变体的诱变动力学可以相当容易地得到验证。[8]
2.2 诱变剂的剂量
从随机筛选的最佳效果看，诱变剂的最适剂量就是在用于筛选的存活群体中得到最高比例的所需要的突变体，因为这会使在测定效价的阶段更省力。
因此在菌株改良以前，为了决定所用诱变剂的最适剂量，并为突变性的增强技术打下基础，聪明的做法通常是测定不同诱变剂处理不同菌种时的突变动力学。用高单位突变本身来测定最适剂量有时是不可能的，因为这种突变的检测很困难。但如使用容易检出的标记如耐药标记，只要估计到方法的局限性，还是可以提供一些有价值的资料的。

8. 在实验室,以及在大规模的微生物工业生产中,如何培养微生物

实验室采用恒温培养箱和摇床等实验设备培养，工业上在实验种的基础上，再采取多级扩大培养的方式，比如从摇瓶种接到立方级别的的种子罐，根据生产需要可以采取多级种扩大的工艺。

9. 微生物主要培养哪些

按照微生物培养基的物理状态分：
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
(3)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
按照微生物的种类分类：
培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。
(1)常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基。
(2)常用的放线菌培养基为高氏1号培养基。
(3)常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基。
(4)常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁蔗糖(或葡萄糖，葡萄糖比较昂贵)琼脂培养基和察氏培养基等。
按照微生物培养基用途分类：
培养基按其特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。
(1)基础培养基。是含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。
(2)加富培养基。是在基础培养基中加入血、血清、动植物组织提取液制成的培养基。用于培养要求比较苛刻的某些微生物。
(3)选择性培养基。是在普通微生物培养基中加入特殊营养物质或化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。