㈠ 如何来设定转录组测序中的生物学重复
如何来设定转录组测序中的生物学重复
1.区分生物学重复与技术重复
生物学重复：指样本重复，比如3只小鼠，同时做一种处理，就是三个生物学重复。
技术重复：一般是三次实验，比如对一块组织，提了三次RNA，做三次real time。
2.设置生物学重复的意义
由于新一代测序技术的优越性以及高成本，曾一度忽略了“生物学重复”的重要性。但生物学重复对于测序实验的设计以及实验数据的解读和分析都非常重要。
设置生物学重复：
能够消除组内误差：生物学重复可以测量变异程度
增强结果的可靠性：测序的样本数越多，越能够降低背景差异
检测离群样本：异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。
案例一：
注：COX4NB和RASGRP1基因在生物学重复样本中表达值的散点图：
左边红色，COX4NB基因表达值的散点图
右边蓝色，RASGRP1基因达值的散点图
上面一行，测序数据的散点图
下面一行：芯片数据的散点图
COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。结果意味着：不同实验组间 COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。
由此可知，设计的实验如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果；获得的差异表达的基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征。
3.生物学重复设置几个合适？
您是不是有同样的问题：转录组测序是否必须进行生物学重复啊，是否要3个重复，是否可以用3个样品的RNA等量混合代替生物学重复，如果不重复能否发文章…..？一方面是有限的经费，一方面是编辑的质疑；实在很难抉择呀~~~
目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。文章投出之后，遭编辑质疑。那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验，FISH荧光原位杂交，或者是northern 杂交等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，然而考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。
注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取了平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。
4.生物学重复分析结果展示
以公司做项目的经验来看，原核生物以及真菌生物学重复的效果>植物>动物，这是由于动植物个体差异较大所导致。所以动植物在选取生物学重复时，应按照严格的筛选条件进行取样，方可得到理想结果。
㈡ 【一文读懂生物学重复与技术重复】
在RNA-Seq等测序设计中，生物学重复和技术重复，是非常需要注意的问题。
那么问题就来了，生物学重复和技术重复，到底是什么？它们是如何影响我们的实验设计的。
生物学重复 （biological replicate）：可以理解为我们对一个群体进行研究，但是我们不会对整个群体进行检测（考虑到成本和工作量的问题，我们肯定也不会采取这种地毯式的方法），只是抽取群体中的一部分进行检测，用样本来代表总体。
这边样本个数，实际上就是生物学重复数。
技术重复 （technical replicate）：对一个样本的数值进行多次测定。
下表给出常见实验对应重复类型：
Replication这篇文章以测定小鼠肝脏细胞中的某一个gene的表达量为例，展示了什么是生物学重复和技术重复以及如何权衡这两者之间的关系。
分别给出3种类型的重复，分别为：
（1）animal水平的重复
（2）cell水平的重复
（3）技术重复
由上图可以得到，3种不同种类的重复，所计算出来的表达量方差是不一样的，但gene表达量的总方差，可以有下列公式计算得到：
接下来，将总体的重复次数限定，即在满足 的前提条件下，对Var(X)进行计算。
1、当 和 均为1， 为48的情况下，计算出来的Var(X)如下图标记：
这种情况下，只反映了由于cell样品重复和技术重复所引起的基因表达量误差。当n_{A}=1（动物样品数为1），即无法计算由于animal样品数变化，所带来的基因表达量误差。
因此在上述情况下， 就被低估了。
2、当 和 均为1， 为48的情况下
计算得到的基因表达量误差完全是由于技术重复所引起的。因此，如果我们将这种情况下的误差，认定为由生物重复所引起的，就造成了假阳性。
同样地，每一种重复对于真实基因表达量的方差贡献也不是相同的。
因为cell重复和测定技术重复，并是一个独立变量。技术重复本质上是对同一份样品进行测定，数据在这种情况下的变异，完全是由于人为或机器造成的，而cell重复在本质上可以认为与animal样品之间存在相关性，因此也不是独立的。
3、从 的角度，来选择replicate
【标注】 越小，代表对 估计越准确
可以看到的是，当增大animal重复数时， 趋于一个稳定值，该样本对总体的估计达到了一个较为准确的水平，同时 的值也接近于0。
4、从统计检验的角度，来选择replicate
使用two-sample t检验，来判断cell样品的gene表达量方差、动物样品表达量均值之间是否存在显着差异。
下图很明显的一个结果就是，随着 的增加，统计检验的效能得到提升，假阳性也在降低（同时也得权衡 和 ）
对于一组数据来说， 研究对象的生物重复比技术重复更能够反映总体 ，因此在进行实验设计时，最好将实验/测序资源倾向这边，而不是技术重复（除非对技术重复所诱发的影响感兴趣）
[1] 刘小乐老师-哈佛计算生物学与生物信息学
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.