❶ qpcr是否一定要有生物学重复
要的。
首先qPCR不是很准，特别是对于新手来说。
其次，三个平燃纤行以上才具有统计学皮首仿意义，三个生物学重复以上才具有生物学意义。（芹乱发表文章时需要）
❷ WGBS测序深度和生物学重复知多少
转录水平的研究中设置多少生物学重复和测序深度比较合适？
生物学重复可以定义为使用来自不同抽提的样本进行实验，例如，上图中同一来源独立制备的3只老鼠。对每一个样本制备来说，只要抽提之后的步骤是独立进行的，那么分析测量就是独立的。虽然对于特定的基因，生物学重复的变异大于技术重复，但是由每一个独立样本引入的偏差通过取每一个测量的平均值几乎消除，因此生物学重复的实验结果易于广泛概括。通常，生物学重复用于概括性结论的验证，技术重复用于减少这些结论的变异性。这也是为啥高分文章需要更多生物学重复。具体两个例子说明下设置生物学重复的重要性：
案例1：Sequencingtechnology does not eliminate biological variability.
图说明：A plot of the expression for two genes COX4NB (left column, pink)and RASGRP1 (right column, blue) as measured with sequencing (top row) andmicroarrays (bottom row) versus biological sample. Mean-centered measurementsfrom the two studies are plotted as circles and triangles, respectively.
从图上看，测序和技术的结果一致性很好（其实测序和芯片技术各有优劣势，以后有机会再说）。COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。这结果意味着：不同实验组间COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。通俗点说，如果癌和癌旁的差异表达是“COX4NB”基因表达形式，那么很容易重复做出结果，而如果三对三筛选出“RASGRP1”的基因表达形式，那么你扩大样本验证就会出现和前期筛选不一致的结果。
案例2：GEO数据库下载两组数据的分析
下图是两组数据，癌（黄线左侧）和正常组织（黄线右侧）筛选的部分差异基因。如果选择3个重复如上方箭头标出的，这个基因就没有差异。如果选择4个重复如下方箭头标出的，这个基因就出现相反的变化水平。
作图软件源自微信公众号《实验万事屋》介绍的GENE-E
说了这么多，大家都知道实验设计中重复越多越好，但是具体多少比较合适，下面几篇文献供参考：
文献A. Howmany biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and whichdifferential expression tool should you use?
数据来源：RNA was sequenced from 48 biological replicate samples ofSaccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）in eachof two well-studied experimental conditions; wild-type (WT) and a Δsnf2mutant. Quality control and data processing steps rejectseveral replicates from each condition resulting in 42 WT and 44 Δsnf2biological replicates of “clean” data totaling ∼889M aligned reads.
这篇文章主要提出了2个问题：
1. 在RNA-Seq实验中需要多少生物学重复提高差异基因鉴定工作的准确性和灵敏度？
参考答案是：至少6个重复以上，12个以上更佳。至于你纠结6个重复怎么来的，请看下图:
2. 在一定重复数量的RNA-Seq中，用哪种统计算法或工具更合适？
参考答案是：.如果每组少于12个重复，相对的edgeR更优秀一些，如果超过12个重复，DESeq更佳。文章使用的统计算法如下表：
另外值得一提的是，这篇文章中的模式生物是酿酒酵母。我“网络”（别鄙视，没办法用google）了下，酿酒酵母菌属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆形或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。它的参考基因组如下:
至于你问我其他物种多少生物学重复合适，我只能说越多越好了。
文献B.Differential expression in RNA-seq: A matter of depth
❸ 转载---[转录组] 转录组专题——关于样本重复性问题小技巧
目前，转录组测序仍是应用最广的高通量测序技术之一，很多研究课题是关于基因表达潜在的机制，并已经发现了一些现象，但分子机制还不清楚。而做转录组测序特别适合用于分子机制探究，可以获得样本中几乎所有的mRNA信息。关于转录组领域的研究，应用范围极为广泛。如可研究同一个体不同组织之间的基因表达差异；或者不同的外界处理条件下（病毒、光照、紫外、干旱、高温和高盐胁迫等），对基因表达的影响。
在我们正式进行转录组数据分析之前，需要先对组内生物学重复（一般设置3个生物学重复）进行样本关系分析，判断组内重复性效果的好坏，是否有离群样本。应广大研究者之需，本期针对大家比较关心的样本重复性问题进行探讨，力争为各位老师在科研之路上带来帮助。
在进行问题讨论之前，首先我们对可能会困扰大家的关于什么是生物学重复和技术学重复的问题进行区分。
①生物学重复： 指同一处理下不同的生物学样品。由于遗传和环境等因素的影响会引起生物体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来降低该差异。一般的实验设计中，都会包括实验组和对照组。如下图A实验组包含3只小鼠，那么这3只小鼠，经过相同的实验处理，分别测组织的RNA-seq，即为一组生物学重复。
②技术重复： 简单来说就是对同一生物体样品进行重复地检测。如下图B、C，都属于技术重复。对于第一种技术重复，重点是检测RNA-seq方法的准确度。比如当发现了一个新的检测基因表达量的方法，就需要用这种重复来验证（图1 B）；第二种技术重复重点是这个小鼠本身的基因表达水平（图1 C）。
图1 生物学重复和技术重复
那么接下来，我们正式切入主题，针对样本重复性问题进行探讨。
‘1. 生物学重复必须要设置吗？’
答：需要。生物学实验中，生物体往往存在异质性，常常需要设置重复，以此确保不是个体的偶然变异对结果产生的影响[1]。若不设置组内生物学重复，在投稿时也会受到审稿人的质疑。我们无法判断组内差异所占的比例有多大，可能获得的差异表达基因仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映是真正处理效应导致的差异。设置生物学重复可以评估组内误差，降低背景差异，检测离群样本，增强结果的可靠性。
Tips
组间差异是由组内差异和处理效应共同导致的[2]。组内差异包括采样个体间的差异、实验操作误差等等，这些差异是我们在实验时要尽可能降低的。而组内误差主要由生物学误差和技术误差引起的。
图2 组间差异和组内差异
‘2. 每个处理推荐多少个生物学重复呢？’
答：不同的实验样品，由于外界因素导致的个体之间的差异或实验操作导致的误差可能不同。因此，针对不同的样品所推荐的组内生物学重复也有所差别[3]。
① 对于动植物样品，建议3~5个生物学重复，对生物学样品之间做相关性检验，提高实验结果的可信度；
② 对于细胞样品，生物学重复之间的差异性相对较小，建议3个以上生物学重复；
③ 对于临床样品，由于供试者的基因型、生活方式、生活环境、年龄、性别可能存在较大差异，可能需要更多的生物学重复，一般10个生物学重复以上[4]。
Tips
在转录组测序时，一般不建议设置两个重复。因为如果两个重复样品结果不一致，无法确定以哪个数据为参考。
‘3. 用于判断组内重复性好坏的常用工具有哪些？’
答：在实际分析过程中确认组内重复性的好坏方法有很多，可进行样本的PCA，可计算两两样本的相关系数，或者绘制样本聚类图、重复性散点图多种方式综合判断。在实际分析中，通常结合PCA和相关性系数综合判断样本是否离群。
① PCA：详见Question 4；
② 相关系数：通常计算两个样品之间的Pearson或Spearman相关系数判断组内重复性情况。相关系数越接近1，样品间相似度越高。一般情况下，组内生物学样本相关系数大于组间样本，则表明组内重复性较好；
③ 样本聚类树：可用于判断在不同实验条件下的表达模式。依据样品的表达谱进行聚类，样品之间重复性较好时通常会聚在同一分支下。如果组内样本重复性较差可能会呈现无规则的聚类形式；
④ 重复性散点图：展示组内样本的重复性情况。图中偏离对角线的点越少，样品间的相关性越高，重复性越好。
图3 Omicsmart中样本关系分析图形
‘4. PCA是什么？怎么看？’
答：主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一种线性降维算法。用方差（Variance）来衡量数据的差异性，将高维数据用某几个综合指标来表示。将原本鉴定到的所有基因的表达量重新线性组合，形成一组新的综合变量，同时根据所分析的问题从中选取2-3个综合变量，使它们尽可能多地反映原有变量的信息，从而达到降维的目的。如PC1（Principal Component 1）和PC2（Principal Component 2）为降维后获得的两个主成分因子，可分别从数据差异性最大和次大的方向提取出来。
在样本关系分析过程中，PCA可以让我们非常直观地看出各个样本之间的相似性。关于转录组测序，我们可能获得上万个基因的表达信息，那么利用PCA可将样本所包含的上万个维度的信息（上万个基因的表达量），降维至某些维度的综合指标（主成分）表示。一般选取PC1和PC2，来解释样本间的重复性好坏与组间样本的差异度。如下图PCA散点图，组内样本呈现相互聚集，说明组内的重复性比较好。
图4 Omicsmart在线报告PCA图
Tips
在文章中，也会看到三维的PCA图。这时选取了PC1，PC2，PC3去解释样本间的距离。PC1+PC2（+PC3）越大，对方差解释度越大，越具有说服力。
‘5. 相关性系数分析时，相关系数达到多少可认为组内重复性效果好？’
答：一般情况下，计算相关性系数时，对于生物学重复（如采样时个体差异）之间的相关系数依据经验建议在0.7以上较好；对于技术重复（实验操作、实验仪器等）之间的相关系数依据项目经验来说在0.85以上比较合理。
Tips
关于相关系数如何计算，可能还存在不少的困惑。我们在这里也解释一下。对于转录组数据，可以利用样本的表达谱来计算样本间的相关性，通过计算相关系数r来评估每组样本的生物重复性。最常用的度量是Pearson和Spearman相关系数。
那么在实际分析中，这两种计算方式应该如何选择呢？
我们首先简单了解二者的区别。对于Pearson相关系数很简单，主要用来衡量两个数据集的线性相关程度。而Spearman相关系数它不关心两个数据集是否线性相关，所关注的是单调相关。所以Spearman相关系数也称为等级相关或者秩相关（即rank）。从下图中我们可以更好的理解，如果对数据进行线性变换（y=ax+b；a≠0），两者相关系数的绝对值都不会发生变化（图5 A）；如果对数据进行单调但不是线性的变换，比如最常见的log scale，Spearman相关系数的绝对值也不会发生变化[5]（图5 B）。这时我们就可以知道，两者的前提假设就不同，Pearson相关假设数据集在同一条直线上，而Spearman只要求单调递增或者递减，所以Pearson的统计效力一般情况下比Spearman要高。但是更重要的是，我们需要根据实际情况选择正确的假设。比如，某个实验做了3次生物学重复，那有理由假设这3次重复线性相关。而如果是一个基因和另一个受到调控的基因的表达水平，或者某个基因顺式作用元件的染色质开放程度，和这个基因表达水平之间的关系就可能需要假设单调相关。
图5 Pearson和Spearman相关系数
关于两者的特点也有所不同，若想要深入学习二者的算法特征，可回顾往期文章 《相关系数第一弹：哪哪都能看到的皮尔森相关》 和 《相关系数第二弹：斯皮尔曼相关》 ，都有详细的解释哟。
‘ 6. PCA和相关系数的算法，哪个更能判断样本的重复性？为什么？’
答：相关系数。因为PCA为把对样品贡献大的信息保留，所描述的是整体所有组的特征；而相关系数直接呈现的是两组样品之间的相关程度。若相关系数越高，表明两组样品之间的相关程度越高，即重复性越好。
‘7. 样本离群了，还能用于分析吗？’
答：首先判断离群程度，若离群程度较小，则可以尝试设置阈值，缩小基因范围，再次重新进行相关性分析判断样本是否离群。若离群程度很大，对后续差异分析的结果造成了很大的影响，那么可以考虑将该样本剔除，再进行后续差异分析等等。
Tips
转录组测序通常要求设置3个生物学重复样本，如果样本足够多，建议比预期实验设计多送1~2个样本测序，以便后续某个样品与组内其它样本出现离群情况，直接剔除离群样本，省时省力。若测序样本较少，无法剔除样本，也可以考虑对同一批次的备份样本再次测序，后续再重新分析。
以上就是今天的关于样本关系分析问题，在此也向广大研究者征集相关问题，如有疑问，欢迎下方留言。或者也可登录基迪奥OmicShare论坛，搜索和讨论更多相关知识。
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▼参考文献▼
[1] Robles, José A et al. Efficient experimental design and analysis strategies for the detection of differential expression using RNA-Sequencing. BMC genomics vol, 13 484. 17 Sep. 2012, doi:10.1186/1471-2164-13-484
[2] Hansen, K., Wu, Z., Irizarry, R. et al. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nat Biotechnol. 29, 572–573. 2011, https://doi.org/10.1038/nbt.1910
[3] Todd E V, Black M A, Gemmell N J. The power and promise of RNA-seq in ecology and evolution[J]. Molecular ecology, 2016, 25(6): 1224-1241
[4] Liu Y, Zhou J, White K P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?[J]. Bioinformatics, 2013, 30(3): 301-304
[5] Trost B, Moir CA, Gillespie ZE, et al. Concordance between RNA-sequencing data and DNA microarray data in transcriptome analysis of proliferative and quiescent fibroblasts. R Soc Open Sci. 2015, 2(9):150402. doi:10.1098/rsos.150402
❹ 转录组数据绘制PCA图以及生物学重复的相关问题
很久没有跟新啦~~~忙着基金。。基金。。还是基金，然后就是文章。。文章。。还是文章。
终于有空整理之前的东西。
说绘图方法之前先要了解，转录组的PCA图的意义是什么？
为了检测样本之间的离散程度，也就是重复之间差的大不大。
1、绘图之前先解答样本重复的问题。
转录组测序一般情况下需要是三个重复。但是对于完全没有接触过测序的人来讲，就很疑惑：转录组测序为啥一定要生物学重复呢？我不要行不行？为啥大部分要3个重复？4个、5个、666个重复行不行呢？怎么样算重复？3只老鼠各测一次算3个重复，还是1只老鼠测三次算3个重复？一堆问题就很纠结，着实让人头大呀~~~
第一个问题：一定要生物学重复吗？
回答：最好要。
那什么情况下可以没有生物学重复呢？
1）科研经费太少，没钱测序。（这种情况就干脆不要测了，测1个就很鸡肋。）
2）实验证据绝对充分，然后想装点一下门面，看起来花哨一些。（那实验都做那么好了，那就多测几个嘛~要不就干脆不要测了。要不然本来能发nature，结果你“貂尾续狗”只能发个plosone，就很没必要。）
第二个问题：一定要3个重复吗？那我测2个或者4个行不行？
回答：重复的数量一定要≥3。
1）先回答设置重复的目的是什么？是为了：消除组内误差；增强结果的可靠性；检测离群样本。
1.1） 假如你给小鼠喂了一种药，不同小鼠对药的反应肯定不同，那么多个样本就可以消除小鼠之间本身的差异。
1.2）再假如，你给3只小鼠喂了药，但是其中一只就是天生免疫力极强，药物对它的影响极小。另外两只就比较相似，那后面分析的时候你就要把免疫力极强的那一只删掉，汪纯芦因为它的数据会对分析结果造成极大的偏差。
1.3）但是，如果你只有2只老鼠，其中一只天生免疫力极强，药物对它的影响极小。拿到测序数据一分析发现两只差别很大，那你选哪一只呢？有人说，那我肯定选免疫力正常的那一只呀。 哎呀 这个问题，真的是。。。只有测序了之后你才能知道免疫力到底强不强，你给老鼠喂药之前你是不知道人家身体到底好不好的。这就是为裤纳啥不要选2个的原因。
2）理论上来说重复越多越好，但是考虑实际情况，设置3个重复还是比较普适的方法。
具体原因参见以下文献：RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?
3）动物或者植物之间样本的差异还是比较大的，所以可以多测一点，例如可以做5-10个重复之类的。土豪的话你可以测任何你觉得吉利的数字，譬如66、88、996甚至2333等等。（玩笑话哈 ）
第三个问题：3只老鼠分别测序算重复，还是1只老鼠测3次算重复？
回答：3只老鼠各测一次。
搞清楚生物困带学重复和技术重复。（自行网络）
2，绘制PCA图
载入绘图的包
设置运行路径并且导入你之前已经计算完的FPKM数据。
计算每个PCA的各项指数。
利用ggscatter对PC进行绘图
或者可以试试3D绘制散点图
3D绘图的不好的地方就是，scatterplot3d里面没有参数让你展示每个点的名字，就很郁闷。
如果想实现就试试下面的方法，我也是google出来的。
❺ 【转载】生物学重复与技术重复
生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
重复是实验设计的重要原则之一，实验重复无论对于实验结果的可重复性，还是对于最终实验结论的可靠性，都起着起决定性的作用。
实验重复还可以进一步细分为生物重复(biological replicates)和技术重复(technical replicates)，那么生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
生物重复和技术重复分别是什么？
生物重复：指对同一个处理组中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型的多个细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除该差异。目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。
技术重复：指对同一样本进行重复地检测分析，例如同一份细胞中抽提的蛋白质进行三次质谱检测，或者对同一RNA-seq样本测序3次。与生物学重复相比，技术重复的测量变异程度较小，从而可以减少实验中的分析变异，将对同一份样本产生高重复性的测量结果 。
简单来讲，生物重复是生物级别的重复，一般都是生物样本的重复。而技术重复，更多的是参数测定环节的重复，一般是对同一生物样本进行多次测定。
进一步分析，其实可以发现生物重复是衡量实验的总波动的（处理组间的差异不列入此处的波动，他们应该称为效应），它包括样本个体间差异和技术重复差异，而技术重复更多的是单纯的衡量参数测量时的波动，如实验操作娴熟程度、仪器稳定性等等。
在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
如此说来，对于一个实验来说，如果条件允许的话，最好把生物重复和技术重复做全了？
然而StatQuest推荐的策略是只需要生物重复即可，不需要技术重复。为什么？
只做生物重复
以小鼠的RNA-seq实验为例，先看一下生物偏差（biological variation）和技术偏差（technical variation ）。
下图代表小鼠的RNA-seq数据，虚线μ是总体小鼠的Read Counts，蓝色条代表5个样本小鼠的Read Counts。那那么样本小鼠的Read和总体μ是存在一定的差异的，我们将5个样本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
随着生物重复的增多，(5-1+4+2-5)/5会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体搜咐均值μ。
刚才只考虑了生物生物偏差，没有考虑技术偏差，下图中添加悄灶了技术偏差，棕色条为生物偏差，绿色箭头为技术偏差，那么此时依然可以取5个样本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着生物重复的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐渐趋向于0，技术偏差也会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体均值μ。
所以只做生物重复就可以很好的使用样本代表总体。
只做技术重复
继续进行实验，下图代表对1#小鼠测定了5次RNA-seq数据。那么同样方法取5个RNA-seq数据的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着技术重复数的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋近于0，而这个平均数会逐渐趋近于μ + 5，永远也不会等于总体均值μ，因此做再多的技术重复，最终的RNA-seq数据也无法很好的代表总体。
同时做生物重复和技术重复
以下图为例，1#小鼠做了2个技术重复，2#小鼠做了3个技术重复，此时的生物偏差为5、5、-1、-1、-1，而技术偏差不变（技术偏差是参数测定时的偏差，不会因样本而异，而且因样本而已的偏差肯定是样本偏差），所以样本均值为：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着样本量启漏扮的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋向于零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5虽然也会收敛到0，但是此时所需要的样本量比‘只做生物重复’时大大增加，也就是说生物偏差的收敛速度变慢了。
这个生物偏差收敛变慢的速度有多慢呢？
假如多了3个技术重复，那么就需要3倍的样本量才能抵得上‘只做生物重复’时的收敛速度。说白了，就是多做的技术重复最多不过和‘只做生物重复’的效果持平而已。
做一下总结：
只做生物重复：最佳的实验设计，可以很好的代表总体；
只做技术重复，没有生物重复：不要使用这种实验设计，永远只会得到总体的有偏估计。
生物重复和技术重复：不推荐做，并不能很好的提高样本的代表性，要么获得一个有偏的估计，要么需要更多的样本。
❻ 生物学重复必须同一时间去做吗
实验设计原则的正确把握：重复原则及其作用
重复原则通常有三层含义，即“重复取样”、“重复测量”和“重复实验”，实验设计中所讲的重复原则指的是“重复实验”。本文本文以实例的方式说明一下临床实验中违背重复原则和重复原则使用不当的常见情况。
重复原则及作用
重复原则的概念
重复通常有三层含义，即“重复取样”、“重复测量”和“重复实验”。从同一个样品中多次取样，测量某定量指标的数值，称为“重复取样”；对接受某种处理的个体，随着时间的推移，对其进行多次观测称为“重复测量”。实验设计中所讲的重复原则指的是“重复实验”，即在相同的实验条件下，做两次或两次以上的独立实验。这里的“独立”是指要用不同的个体或样品做实验，而不是在同一个体或样品上做多次实验。整个实验设计所包括的各组内重复实验次数之和，称为样本大小或样本含量。
重复原则的作用
同一个实验条件下为何要做多次独立的重复实验呢？只做一次不更节省时间柏费用吗？
关键在于观测的结果是否具有变异性，若对每一个正常人观测其有多少个手指，只需观测一个人即可，因为每个正常人的手指都有10个，它是一个不具有变异性的定量指标。若对每一个正常入观测其血小板的含量是多少，仅观测一个人就作出关于正常人血小板含量为多少的结论显然是可笑的，因为每个正常人血小板含量是不尽相同的。只有观测了大量正常人血小板的含量后，其取值规律性才有可能表现出来，初步的印象是取值接近该组被观测的全部受试者算术平均值的人较多，取值偏离此均值较远的人较少，取值特别小和特别大的人就吏少了。即便这样一种非常简单的规律，也只有在进行了大量重复实验之后才能够表现出来。
由此可如重复原则的作用就在于它有利于使随机变量的统计规律性充分地显露出来。
96孔板的实验，比如MTT，luciferase reporter等实验室，单次至少3个复孔，需要至少3次独立重复实验（肯定不是一天做的）。
WB实验，收样的时候可以不用做复孔，分装蛋白的时候可以分几份跑胶，也可以就跑一次。但是结果至少重复3次（三批的样本）保证重现性。
PCR实验，收样的时候不需要复孔，但是p的时候至少设置3个复孔，且至少3次独立重复实验，也就是说你等收三批以上的RNA样本。
染色实验，组织样本，至少来源于3只以上的动物，这个具体看你用什么模式生物，小鼠得6只，大鼠3只。每个组织至少有3-5张切片进行染色。最后分析的时候如果是扫描图片可以是一张整图，如果是放大的截取的图片，那至少观察5个以上的视野。细胞样本染色，6孔板或者比6孔板大的染色，我一般做1-2个复孔，其实一个也可以。96孔这种，至少也需要3个复孔.且都需要做3批以上。
CoIP, IP pulldown因为最后处理相当于WB,参考WB即可。
ChIP参考PCR即可。
RNA-seq, ChIP-seq,>3个重复样本。
注意：文章中的n=5，动物实验的话是指有5只动物，细胞实验是指5个独立实验，也就是5批实验的结果，不是5个复孔的意思。
❼ 生物学重复是什么应该怎么设置
"生物学重消蔽唯复"指的是经过相同方式处理的相同样品。
对照组A、B、C三只小鼠 (control A, B and C) 互为生物学重复。实验组A、B、C三只小鼠(Treated A)同样互为生物学重复。
"生物学重复"的概念容易与"技术重复"相混淆。一般来说，技术重复指的是同一样品多次测量。并销如图所示，拿培任一小鼠在板A、B、C中被重复测量了三次，即技术重复了三次。
❽ 技术重复实验一般几次
技术重复：通俗讲就是操作重复，简
单理解一般就是三次实验，比如洞猛对一
块组织，提了三次RNA，做三局颤次real
time。 2、为什么设置生物学重复纳腊桥。
❾ [转录组] 生物学重复到底设定多少个合适
我打算做一个RNA-seq项目，研究一株细菌在两个环境条件下的表达差异。现在，我打算确定生物学重复的个数，以便可以得到统计学上有意义的结果。我打算每个环境的样本设置两个生物学重复，而不打算测更多重复。请问，两个重复的设置是否合理？
1.如果是我的话，我会选择设置三个生物学重复。要知道两个生物学重复意味着双倍的工作量但没有双倍的效果。如果做两个生物学重复，你会引入无法校正的噪音。如果两个重复结果一样，那能说明问题，但如果不一样，你就解释不了了。如果样品制备不是非常难，经费不是非常有限，我建议还是设置3个生物学重复吧{:4_239:}
2.这是个有意思的问题，从统计学的角度来说
排除生物学意义，从统计学的角度来说，不同的统计方法，对生物学重复的个数的要求并不相同。
如果使用T检验，你应该设置尽可能多的生物学重复，建议至少3个重复。当然T检验的方法，在RNA-seq的差异分析里不是很合理。因为RNA-seq的误差分布，并不符合正态分布。
如果你选择的统计模型是Fisher 精确检验类的统计模型（包括超几何分布或泊松分布），即使没有生物重复也是可以进行统计的。当然，没有生物学重复只是在统计学上可行，但实际上无算估算生物差异或实验误差带来的系统误差。所以，这样的策略现在发表论文的话，可能会被质疑的。
如果你选择一些软件，例如Deseq这样的软件，一般也要求2个以上的生物学重复。
这个是非常有意思的问题，我提供的建议非常有限，期望其他人有更好的回答。
“虎式坦克”的回答不错。关于生物学重复与统计的关系，我补充一下。在我们的测序样本中，每一个基因表达量的方差包含两个方面的内容：
1）处理方差，就是我们的实验处理导致的差异，这些差异当然就是我们关注的；
2）误差方差，就是与我们实验处理无关的差异，例如，生物个体间的差异，实验技术不稳定导致的偏差等。误差方差并非我们关注的，但这些差异会引入假阳性。
所以生物学重复的价值在于帮助我们估算误差方差的大小，从而我们可以从总体方差中剔除误差方差的影响。
以上的内容，就是生物统计学中“方差分析”所讲的内容。其实RNA-seq差异分析的主体思路和方差分析基本相同，只是把误差分布的假设从方差分析的正态分布，替换为了其他更合理的分布，例如负二项分布。 那么，生物学重复在这里的意义就是用于计算误差方差的大小。因为生物学重复间不存在处理效应，任何差异都属于误差方差的范畴。
但还需要补充一点，由于我们大部分二代测序只有2~3个生物学重复。这么少的重复数，正确预估每个基因误差方差其实是不够的（也就是单个基因的方差估计很不稳定）。所以，一般的差异表达分析软件（例如，Deseq，edgerR）使用了一个代偿的方法。这个方法假设：对于表达量相似的基因，其误差方差也应该是相似的。所以在Deseq里面，会使用所有基因的方差获得拟合曲线，来获得不同表达量的基因的期望方差（如下图）。在重复数比较少的情况下，拟合得到的期望方差理论上会比单个基因的估算更准。携扰
回答完统计学角度的问题，我们再从生物学试验设计的角度来考虑重复数设置的问题。我们一般会建议老师测3个生物学重复，除了统计角度的考虑，还有考虑试验的意外因素。如果测两个重复，而其中一个样本发现有问题而需要被剔除，辩铅旦就会导致这组数据将非常不可信。但如果我们有三个重复，剔除一个样本后，依然留有两个样本，保证这组数据依然是有重复的。
我认为从统计的角度，4个重复是理想的。当然，从费用的角度来说，目前依然是太贵了。随着测序价格不断下降，重复的设置应该会慢慢提高激宴的。
关于实验重复对RNA-seq的影响，可以阅读以下两篇论文。第二篇论文尤其值得看看。
Statistical Design and Analysis of RNASequencing Data.Genetics, Vol. 185, No. 2. (1 June 2010), pp. 405-416.
Efficient experimental design and analysis strategies forthe detection of differential expression using RNA-Sequencing.Robles et al. BMCGenomics 2012, 13:484
❿ 物理重复和生物学重复都必须要吗
可以都要
如果你的高通量的数据是要放到文章里面去的，甚至有人仅仅芯片的数据就发一篇文章，那一定要有n>=3的生物学重复。如果只是自己看一看，找个方向，那可以不做重复。但是，问题来了，如果是组织样，组内差异很大，不做重复也没意义。如果是细胞株，可能好一些。生物学重复是必要的，就是样本和总体的关系，样本越大越能代表总体