土壤微生物如何跟数据库比对

Ⅰ 为什么说土壤是人类最丰富的菌种资源库如何从中筛选出所需的菌种

土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。其原因在于土壤含有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤含有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其间的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的 pH 值范围在 3.5–10.0 之 间，多数在 5.5–8.5 之间。而大多数微生物的适宜生长 pH 也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中，也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢，这一特性极为有利于微生物的生长。如土壤温度夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。
因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。
实验步骤：
一、PDA培养基的配制
1、原料准备：
1000ml水：200g薯仔：20g蔗糖：15—20g琼脂

二、牛肉膏蛋白胨培养基的配制
1、原料准备：
1000ml水：3g牛肉膏：10g蛋白胨：5gNaCl：15—20g 琼脂

三、倒平皿
1、培养基、培养皿、涂抹棒、枪头、无菌水等置于高温灭菌锅121摄氏度灭菌25min；超净工作台紫外线消毒20min。
2、将培养基、培养皿、涂抹棒、枪头、无菌水等移入超净工作台中。
3、将培养基倒入培养皿（培养皿三分之一容积），在酒精灯火焰附近（火焰周围10厘米左右）操作。
4、开盖至冷却，盖上盖子。
四、土壤溶液的配置与涂布
实验原料：
土壤样本10g、90ml 无菌水（锥形瓶中）、9ml 无菌水(试管)、培养皿
实验步骤：
1、电子天平准确称取10.00 g 土样，加入90ml 无菌水中，振荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。
2、将试管依次编号1-6，用移液枪移取1000微升悬浊液置于1 号试管，再移取1000微升 1号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管。
3、涂布
①、用移液枪分别取4、5、6号试管溶液各200微升（每个试管取2—4份）置于培养基中并做好标记（土壤采集地、操作人、溶液浓度级）。
②、用涂抹棒均匀涂抹培养基中的土壤溶液。
（以上均在超净工作台酒精灯火焰附近操作，确保无菌环境）
4、在恒温干燥箱中培养，观察。
五、菌种的分离纯化
1、超净工作台紫外线消毒20min。
2、将要分离菌株的培养基及倒好平板的培养基，接种环，酒精灯转移至超净工作台中。
3、点燃酒精灯，在酒精灯火焰旁操作。
4、将接种环在火焰上灼烧至红，在火焰旁冷却后接取菌种。
5、将菌种用划线法或点种法接于培养基中。
6、取出，移至恒温培养箱中培养。
7、定期观察菌种生长情况。

Ⅱ 如何计算土壤微生物的菌数(稀释涂布法）

土壤中微生物种类很多，根据你想要的菌配制所需要的培养基就行了，很简单啊。

Ⅲ 从澡堂获得一种土壤，知道里面含有嗜热菌，但不知道是什么，怎么把它培养筛选出来进行鉴定！！求详细步骤！

1、稀释平板法分离培养：取1克土壤放入灭菌的试管中，加入9毫升无菌水，充分混匀；取出1毫升稀释液，加入另一只乘有9毫升无菌水的试管中，充分混匀；再取出1毫升稀释液，加入另一只乘有9毫升无菌水的试管中，充分混匀；依次类推，分别稀释1百倍、1千倍、1万倍。从不同稀释倍数的稀释液中分别取0.1毫升，涂布与细菌培养基平板上（如LB固启档李体培养基），放在65℃的培养箱中培养1-5天，直到有明显的单菌落长出为止。
2、菌种纯化：等有明显的单菌落生长出来后，将不同形态的单菌落，划线分离纯化，在相同的培养条件下，获得纯化的耐热菌。将这些耐热菌转接在新鲜培养基上，在30℃培养，不能生长或生长非常缓慢的可以视为嗜热菌。
3、菌种鉴定：提取细菌（一般分离出的嗜热菌都是细菌）的基因组DNA，PCR扩增其16S rDNA，送公司测悄迟序，测序结果与GenBank数据库中已知序列比对，即可获得种属信息。如果再蠢模详细鉴定，还要做生理生化试验，并与模式菌株进行比较。

Ⅳ 土壤质量评价的评价指标

土壤质量是土壤的许多物理、化学和生物学性质，以及形成这些性质的一些重要过程的综合
体现，土壤质量指标则是土壤属性的外在量度，由于对各种土壤属性与功能之间的关系，以及形成各种土壤属性的过程机理等问题尚未十分明确，土壤质量评价体系仍无明确标准，土壤质量的研究仍然只是从不同关心角度进行的尝试。目前国内外科学家采用的评价土壤质量的指标体系不尽一致，可根据不同的土壤和不同的评价目的，选择不同的评价指标体系。大致可分为两类，一类是描述性指标，即定性指标，而不是定量化指标，因此被视为“软”数据。如土壤颜色、质地、紧实性、耕性、侵蚀状况、作物长势、保肥性等，农民往往通过这些描述性指标定性认识土壤质量状况，但科学家和技术人员不太重视这些指标。另一类是分析性定量指标，选择土壤的各种属性，进行定量分析，获取分析数据，然后确定数据指标的阀值和最适值。
1.根据分析性指标的性质，土壤质量的评价指标分为土壤物理指标、土壤化学指标、土壤生物学指标三方面。
（1）土壤质量的物理指标
土壤物理状况对植物生长和环境质量有直接或间接的影响。土壤物理指标包括土壤质地及粒径分布、土层厚度与根系深度、土壤容重和紧实度、孔隙度及孔隙分布、土壤结构、土壤含水量、田间持水量、土壤持水特征、渗透率和导水率、土壤排水性、土壤通气、土壤温度、障碍层次深度、土壤侵蚀状况、氧扩散率、土壤耕性等。
（2）土壤质量的化学指标
土壤中各种养分和土壤污染物质等的存在形态和浓度，直接影响植物生长和动物及人类健康。土壤质量的化学指标包括土壤有机碳和全氮、矿化氮、磷和钾的全量和有效量、CEC、土壤pH、电导率（全盐量）、盐基饱和度、碱化度、各种污染物存在形态和浓度等。
（3）土壤质量的生物学指标
土壤生物是土壤中具有生命力的主要部分，是各种生物体的总称，包括土壤微生物、土壤动物和植物，是评价土壤质量和健康状况的重要指标之一。土壤中许多生物可以改善土壤质量状况，也有一些生物如线虫、病原菌等会降低土壤质量。应用较多的指标是土壤微生物指标，而中型和大型土壤动物指标正在研究阶段。土壤质量的生物学指标包括微生物生物量碳和氮，潜在可矿化氮、总生物量、土壤呼吸量、微生物种类与数量、生物量碳/有机总碳、呼吸量/生物量、酶活性、微生物群落指纹、根系分泌物、作物残茬、根结线虫等。
2.根据土壤质量评价指标的选择原则，土壤质量的评价指标分为农艺指标、微生物指标、碳氮指标和生态学指标。
（1）土壤质量评价的农艺指标
对土壤做出适宜性评价，直接与农业的可持续性相关联，需选择与土壤生产力和农艺性状直接有关的参数指标。吴启堂等(1995)选用了10个参数指标，即①质地，②耕层厚度，③pH，④有机质，⑤全氮，⑥碱解氮，⑦速效磷，⑧速效钾，⑨容重，④CEC。对这些参数项目进行分级赋值，可以得到定量评价值，这种以农艺基础性状为主的土壤质量评价对于农林业生产具有指导意义。
（2）土壤质量的微生物学指标
土壤微生物是维持土壤质量的重要组成部分，它们对施人土壤的植物残体和土壤有机质及其它有害化合物的分解、生物化学循环和土壤结构的形成过程起调节作用。土壤生物学性质能敏感地反映土壤质量的变化，是评价土壤质量不可缺少的指标。但由于土壤生物学方面的指标繁多，加上测定方面的难度，下面的指标可供选择。
①土壤微生物的群落组成和多样性：土壤微生物十分复杂，地球上存在的微生物约有18万种之多，其中包含藻类、细菌、病毒、真菌等，1g土壤就含有10000多个不同的生物种。土壤微生物的多样性，能敏感地反映出自然景观及其土壤生态系统受人为干扰(破坏)或生态重建过程中的微细的变化及程度。因而是一个评价土壤质量的良好指标。
②土壤微生物生物量：微生物生物量(microbialbiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量。它与土壤有机质含量密切相关，而且微生物量碳或微生物量氮转化迅速。因此，微生物量碳或微生物量氮对不同耕作方式、长期和短期施肥管理都很敏感。
③土壤微生物活性：土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
④土壤酶活性：土壤酶绝大多数来自土壤微生物，在土壤中已发现50-60种酶，它们参与并催化土壤中发生的一系列复杂的生物化学反应。如水解酶和转化酶对土壤有机质的形成和养分循环具有重要的作用。已有研究表明，土壤酶活性和土壤结构参数有很好的相关性。它可作为反映人为管理措施和环境因子引起的土壤生物学和生物化学变化的指标。
高质量的土壤应具有稳定的微生物群落的组成、生物多样性及良好的生物活性。土壤徽生物是表征土壤质量最有潜力的敏感性指标之一。因此，建立土壤质量的微生物学指标受到科学家的重视。美国土壤微生物学家(Kemedy等，1995)根据可接受的测定项目和方法，提出了下面土壤质量微生物学指标体系：①有机碳，②微生物生物量，A总生物量，B细菌生物量，C真菌生物量，D微生物生物量碳、氮比，③潜在可矿化氮，④土壤呼吸，⑤酶活性，A脱氢酶，B磷酸酶，C精氨酸酶，D芳基硫酸酯酶，⑥生物量碳与有机碳比，⑦呼吸量与生物量比，⑧微生物群落，A基质利用，B脂肪酸分析，C核酸分析。
（3）土壤质量的碳氮指标
通常把土壤有机质和全氮量作为土壤质量评价的一个重要指标。其实，更合适的指标是生物活性碳和生物活性氮，它们是土壤有机碳和有机氮的一小部分，能敏感反映土壤质量的变化，以及不同土地利用和管理如耕作、轮作、施肥、残留物管理等对土壤质量的影响。
所谓生物活性有机碳是通过实验法和数学抽象法来定义的。前者分离有机碳的活性组分，按有机碳的稳定性划分为若干组。后者根据土壤有机碳各组分在转化过程中的流程位置及其稳定性，用计算机模拟建立多个动态碳库，活性有机碳库的转化快，转化速率常数较大，土壤活性有机氮反映了土壤氮素供应能力，它可被视为一个单独的氮库，或根据土壤有机质分解动力学分成几个组分。活性有机氮，常用3种表示方法：微生物生物量氮(MBN)，潜在可矿化氮(MN)和同位素稀释法测定活性有机氮(ASN)。MBN主要是微生物生物量N和少量土壤微动物氮。PMN是指实验室培养测定的土壤矿化氮，包括全部活性非生物量氮及部分微生物生物量氮。ASN是指参与土壤中生物循环过程中的氮，即用同位素稀释法测定的活性
非生物量氮及固定过程中的微生物生物量氮。（4）土壤质量的生态学指标
物种和基因保持是土壤在地球表层生态系统中的重要功能之一，一个健康的土壤可以滋养和保持相当大的生物种群区系和个体数目，物种多样性应直接与土壤质量关联。关于土壤与生态系统稳定性与多样性的关系，国内已有较多的研究，土壤质量的生态学指标主要有：
①种群丰富度：包括种群个数、个体密度、大动物、节肢动物、细菌、放线菌、真菌等。
②多样性指数：生物或生态复合体的种类、结构与功能方面的丰富度及相互间的差异性。
③均匀度指数：生物个体或群体在土壤中分布的空间特征。
④优势性指数：优势种群的存在及其特征。
某些土壤性状在土壤质量评价中显得十分重要。美国土壤学家提出了土壤质量分析最小指标矩阵(Papendick，etal，1995)，其参数为：①团聚性(aggregation)，②容重(bulkdensity)，③至硬盘的距离(distancetohardpan)，④渗滤性(infiltration)，⑤电导率(conctivity)，⑥持水率(waterholdingcapacity)，⑦pH，⑧有机质(organicmatter)，⑨可矿化氮(mineralizablenitrogen)，⑩呼吸作用(respiration)。
3.根据土壤质量评价指标涉及的内容，土壤质量指标可分为以下四个方面。
(1)土壤肥力：土壤肥力因素包括水、肥、气、热四大肥力因素，具体指标有土壤质地、紧实度、耕层厚度、土壤结构、土壤含水量、田间持水量、土壤排水性、渗滤性、有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、缓效钾、速效钾、缺乏性微量元素全量和有效量、土壤通气、土壤热量、土壤侵蚀状况、pH、CEC等。土壤肥力退化主要是指土壤养分贫瘠化，为了维持绿色植物生产，土地(壤)就必须年复一年地消耗它有限的物质贮库，特别是植物所需的那些必要的营养元素，一旦土壤中营养元素被耗竭，土壤就不能满足植物生长。
(2)土壤环境质量：背景值、盐分种类与含量、硝酸盐、碱化度、农药残留量、污染指数、植物中污染物、环境容量、地表水污染物、地下水矿化度与污染物、重金属元素种类极其含量、污染物存在状态及其浓度等。
(3)土壤生物活性：微生物量、C/N、土壤呼吸、微生物区系、磷酸酶活性、脲酶活性等。
(4)土壤生态质量：节肢动物、蚯蚓、种群丰富度、多样性指数、优势性指数、均匀度指数、杂草等。 土壤质量评价指标选择原则
有效性原则：选取的指标能正确反映出土壤的基本功能，是土壤中决定物理、化学及生物学过程的主要特性，对表征土壤功能是有效的。
敏感性原则：选取的土壤质量指标对土壤利用方式，人为扰动过程，土壤侵蚀强度及程度的变化有足够敏感的反应。如果所选指标对土壤变化反应不敏感，则对监测土壤质量变化没有使用价值。但是，指标的敏感性要以监测土壤质量变化的时间尺度而定。
实用性原则：选取的土壤质量指标要易于定量测定，简便实用。在田间或实验室测定时，测定过程稳定，测定误差低，具有较高的再现性与适宜的精度水平。
通用性：影响土壤质量的因素很多，必须立足于综合的、系统的观点。通过分析各种土壤特性在土壤质量形成中的主次作用，选取那些有重要影响的指标，尤其是不要遗漏制约土壤生产力的主要指标。另一方面，也不要无限制地扩大指标的选择面，使整个指标体系复杂化。
一般说来，反映土壤质量与土壤健康的诊断特征可以分成两组，一组是描述土壤健康的描述性特征，另一组是分析性指标，具有定量单位，常为科学家所用。分析性指标通常包括物理指标、化学指标和__生物指标，在土壤质量评价中需要根据不同的土壤、不同的评价目的，按照上述指标选择原则对这些指标进行取舍组合。
（1）土壤物理指标
由于土壤结构的稳定性控制了生态系统内的许多功能，是土壤最基本的质量指标。在评价土壤质量的基本定量体系中，物理性指标包括：土壤质地、土层和根系深度、土壤容重和渗透率、田间持水量、土壤持水特征、土壤含水量。Larson和Pierce（1991）提出了用于控制土壤侵蚀或防止地表水和地下水污染的物理指标为：土壤质地、结构和强度，植物有效水和最大扎根深度；Fitzpatriok（1996）则指出土层的厚度、土壤的结构性在景观中的分布可用来评价土壤与流域过程及土壤生产力，是最通常、简便的指标，同时指出土壤质地与植物生长和水分运移密切相关，是重要的物理指标。Cass（1996）认为土壤退化的程度与土壤结构稳定性有关，选取土壤分散性、土壤强度、水分吸收速率作为关键的物理指标。
（2）土壤化学指标
土壤质量的化学指标包括有机C和N，矿化态的N、P、K、pH、电导率。Duxbury（1994）提出土壤有机质生物活性部分更适于作为土壤质量的指标。Anderson（1990）在考虑评价土壤质量的有机质快速指标时，建议采用微生物活性指标——代谢商。土壤活性有机氮反映了土壤氮素的供应能力，与农业持续发展及环境质量紧密相关，可作为衡量土壤质量的一个重要指标。在测出土壤全N或有机质水平的变化之前，土壤潜在矿化氮（PMN）和土壤活性氮（ASN）的变化就可测到。在确定土壤质量变化时，土壤活性氮是一个灵敏的指标。但是，有关PMN和ASN在年际水平上的动态变化资料不多，进一步的工作是确定如何使用这些参数以及它们各自的局限性。
由于土壤有机质可以对土壤质量和作物产生有益的影响，研究认为SOM是土壤质量的中心指标（美国水土保持学会，1995），甚至把它看作是土壤质量衡量指标中的唯一重要的指标（Larson和Pierce1991；Doran等，1996）。
Singer和Ewing（1999）还强调了污染物对土壤质量的影响，并提出了将污染物的有效性、浓度、活动性和存在状态作为重要化学指标。
（3）土壤生物指标
土壤中的生物是维持土壤质量的重要组成部分，土壤生物学性质能敏感地反映出土壤质量健康的变化，是土壤质量评价不可缺少的指标。生物学指标包括土壤上生长的植物、土壤动物、土壤微生物，其中，应用最多的是土壤微生物指标，多数研究认为，土壤微生物(包括微生物量、土壤呼吸等)是土壤质量变化最敏感的指标。
Kennedy（1995）提出的土壤质量微生物指标包括生物量、细菌、真菌、土壤呼吸、微生物区系以及与微生物活动有关的参数。Turco（1994）认为一个高质量的土壤应该具有良好的生物活性和稳定的微生物种群组成。在农田系统中，在测定土壤有机质变化之前，微生物群落对土壤的变化就可提供可靠的直接证据。微生物多样性指标可评价自然或人为干扰对微生物群落的影响，进一步揭示土壤质量在微生物数量和功能上的差异。对土壤微生物多样性状况的常规检测方法仍处于实验室阶段，一般将微生物量作为常规的土壤质量指标。进一步的工作是确定一套评价土壤质量中生物部分的最小参数集，这些指标应同时考虑生物学过程和种群多样性，能反映干扰的影响，准确评价系统的功能，而且应该是廉价和快速的。
Dick（1994，1996）提出土壤酶活性是作为反映管理措施和环境因子引起的土壤生物学和生物化学变化的指标，尤其是非专一性和水解性的土壤酶活性十分适合这种指标。利用土壤酶活性评价干扰对土壤质量影响时，需要与参照系或特定地区状况进行比较。为简化评价步骤，合理评价某个时刻的土壤质量，有些研究者提出了综合指标，如生物肥力指标、酶数量指标、水解系数指标等，以对酶活性作出评价。对于土壤质量的酶活性指标，科学研究的重点是寻找一个相对或统一的指标；它不需要通过在时间上的多次测定或在处理间的比较来作解释，统一指标应当是土壤生物学、化学和物理学重要参数的综合。 在土壤质量调查中，根据评价的目的、对象、区域环境条件、污染源和污染状况确定调查项目。选择的参数过少或者过多，都不能反映土壤的综合污染特性。从理论上讲，应选择那些与土壤质量的形成和变化有重大关系的参数。譬如以有机物污染为主的地区，选择油、苯并(a)芘、DDT、六六六等。在用生活污水灌溉的地区，主要选择与一般卫生标准有关的参数，如细菌、病菌、蛔虫卵等。在冲积扇上部土层薄的地区，为了保护饮用水源，要注意易溶于水的污染物，如酚、氰、氮、磷等。在平原地区则要注意易溶性盐类。在用含重金属的工业废水或矿区废水灌溉的地区，由于重金属在土壤中不易迁移而易于累积,应选择难迁移的重金属，如汞、镉、铅等。
确定调查项目后，一般采用传统的方法进行调查，在调查中可根据地区的大小选用适当的比例尺以提高调查数值的精确度。比较精确的方法是按方格网络法进行调查。由于方格网络法工作量较大，也可在前一方法调查的基础上绘出等值线，再以内插法补足每一方格数值,用方格网络表示出来。
评价土壤质量要有一种相对的、可比的单位作为衡量尺度，一般采用土壤质量指数。单个污染物质量指数的一般模式为Pi=Ci/Si。式中Pi为污染指数,或称分指数；Ci为污染物的实测值；Si为污染物的
评价标准。
综合质量指数的模式，一般采用单个污染物的质量指数相加，或相加后再平均的方法。即： 式中n 为污染物的种类数。有人利用模糊数学中的系统聚类分析对单个污染物的质量指数进行综合，效果较好。 为了进行评价，绘制质量图，要对求出的指数进行分级。分级一般是先定出“开始污染”和“严重污染”的起始值，然后将两者之间的数值根据需要分为若干级。“开始污染”的起始值一般采用土壤背景值。“严重污染”的起始值一般以土壤环境质量标准表示，或以作物体内污染物含量超过卫生标准时的土壤中污染物含量来表示。也有人以作物减产到一定程度时土壤中的污染物的
含量作为依据。

Ⅳ 高通量测序中如何判断土壤微生物数量的多少

在陆地生态系统中，在土壤中生活有数量庞大的微生物种群，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物, 以及真核生物如真菌、藻类( 蓝藻除外) 、地衣等。它们与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S 等物质循环的“调节器”[1 ]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2 ]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性[3 ]。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等现代生物学分子生物学技术的迅速发展, 人们对土壤微生物多样性有了更多的了解；高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。
一、对土壤微生物进行研究的方法
1、微生物平板培养法
传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。
这种方法只限于极少量（0.1%-1%）可以培养的微生物类群，无法对绝大多数微生物的分类地位和系统发育关系的深入研究。
2、分子生物学技术结合测序的方法
在过去的20多年里，分子生物学技术，尤其16SrDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌的研究中。20世纪80年代以来, 逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、稳定同位素探针( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200bp ～900bp为佳，超出此范围的片段难以检测[4]，PCR 扩增所需G/C 碱基对含量至少达40 % ，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到[5]。TGGE 仪器所允许的温度范围为15 ℃～80 ℃，较大片段DNA 的Tm 值因为接近80 ℃而使检测难度提高；若电泳条件不适宜，不能完全保证将有序列差异的DNA片段分开，从而出现序列不同的DNA 迁移在同一位置的现象。
3、高通量测序方法
近年来，16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600碱基的序列，足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[8]，因此454高通量测序的方法因其读长（400~500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogenetic analysis)。
高通量测序的优越性体现在：测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域； 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物；实验操作简单、结果稳定，可重复性强；无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验周期短；测序数据便于进行生物信息分析。
该方法得到顶级期刊的认可（Nature等），已成为土壤微生物多样性检测的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，为客户提供的土壤样本进行高通量测序并进行生物信息学分析。高通量测序因其数据量大，操作过程简单，尽可能避免了繁琐的实验操作过程所造成的样本损失，能够相对客观的反应出土壤样本的真实情况。
二、高通量测序在土壤微生物研究中的应用
1、 研究土壤微生物的物种多样性
微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性，或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成不同的功能群(function group)，通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的产甲烷细菌、固氮菌、根瘤菌等的多样性进行研究。以下是几篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454测序法对西半球的一个大的横断面的4类土壤进行检测和统计学评价。结果表明，这4种土壤中，最丰富的微生物类群拟杆菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而检测结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少，仅为该位点所有序列的0.009%，而农业土壤的比例则为4% -12%。
土壤中细菌的多样性差距非常大，因土壤结构的不同土壤中的细菌群体也呈现出多样化。Triplett等[10]基于焦磷酸测序法来对16S rRNA的V2-V3区域进行测序，估测9个草地土壤中的菌群的整体和垂直特性。对所有752,838条数据序列进行聚类分析，探索菌群在丰度、多样性和组成成分等方面的特异性。作者发现在不同的土壤层中，细菌系统发生的种群或者亚群的不同分配是与土壤的性质有关的，包括有机碳含量、总含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多样性
土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等, 通过分析测定土壤中的一些转化过程, 如有机碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等来了解土壤微生物功能。
氨氧化反应是硝化作用的第一步，也是全球氮循环中由微生物活动形成硝化盐的重要进程。Leininger[11]检测了3个气候区域12块原始和农业用地的土壤里编码氨单加氧酶(amoA)的一个亚基的基因丰度。采用反向转录定量PCR研究及无需克隆的焦磷酸测序技术对互补DNA测序，证实古细菌的氨氧化活性要远高于细菌，证实Crenarchaeota可能是土壤生态系统中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的环境转录组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信息。结果认为，通过该方法可以同时研究微生物生种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。群落基因组学分析可以通过研究微生物基因组序列与某些表达特征之间的关系，获得一些微生物功能方面的信息。但同时也需要运用其他方法将特定功能与具有这种特定功能的微生物群落结构对应起来。对rRNA表达基因和与环境因素相关的主要酶类的基因进行定量化和比较分析，将能了解微生物结构与特定功能之间的关系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是参与到氮流失和温室气体排放等氮循环过程的重要流程之一。通过宏基因组测序的方法，结合分子检测和焦磷酸测序，Ryan等分离鉴定了操纵编码反硝化过程的酶类。通过筛选77,000个土壤宏基因组文库中得到的克隆，最终分离并鉴定了9个参与反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。Zachary等[14]以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。通过液相色谱/质谱（LC-MS），作者确定H218O中的氧原子结合到了所有的DNA结构成分中。尽管这种结合不是均匀的，还是可以明显的将标记了18O和未标记的DNA区分开来。作者发现DNA和细胞外的H2O中的氧原子在体外没有发生交换，表明掺入DNA的18O是相对稳定的，并且掺入到细菌DNA中的18O的比例较高（48-72h）。土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究和生态类群的划分。

Ⅵ 如何计算土壤微生物的菌数

计算土壤微生物数量，常见的有两种方法，一种是传统的培养法，即平板法，将一定质量的土壤制成则芦悬嫌虚浮液，稀释后涂到培养基上，培养18-24h，在显微镜下找菌落数目，乘以稀释倍数，粗略估算细菌数量。但这种方法只能得到可培养的微生物数目，仅占土壤总细菌的1%，另外99%的微生物是不可培养的，用这种方法得到的值只是参考数值；
第二种方法是高通量测序的方法，提取土壤总DNA，通过测定土壤中所有DNA的碱基序列，与细菌的碱基序列数据库比对，得到细菌的名称（操作分类单位，OTU），根据序列的条数大概估算这类微生物所占的比例。但这种方法无法区分死亡的细菌和活着的细菌，也有一定孙者带的局限性。

Ⅶ 土壤微生物的检测怎么做，哪里可以做

土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，严格意义上应包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有几亿到几百亿个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机物的分解和养分的转化；那土壤内的微生物如何测定呢，下面喆图小编带大家来了解一下。

一、培养方法

（1）稀释平板涂抹法

具体操作如下：

①准确称取 10g（精确到 0.001）采集的鲜土，倒入装有 90 ml 无菌水的 500 ml 的三角瓶中，置于往返震荡机上（120r/min，常温），震荡 20 min，使土壤充分分散成为土壤悬液。

②将上面的土壤悬液用无菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀释液中，即为 10-2稀释度，依次按 10倍法稀释，制成 10-1~-~10-6稀释度。注意:每次吸取悬液时,在稀释液中反复吸入和吹出 3-~5 次,减少因管壁吸附而造成的误差,并使悬液进一步分散,每个稀释度需要更换无菌吸管吸取悬液。)

③根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度的悬液接种。本实验选择细菌的稀释度为 10-~10-5,放线菌为 10~-10-4,真菌为 10-1~-10-3。 -3-2

④土壤悬液的接种方法:在无菌培养皿中倒入 15~20 ml 选择性培养基,待凝固后,用 0.2 ml无菌移液枪吸取0.2 ml各稀释度的土壤悬液,然后立即用涂抹棒将悬液均匀的涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种时,从高稀释度开始,依次接种到低稀释度。

⑤接种了土壤悬液的培养皿,平放在超净工作台 20~30 min,使得菌液渗透入培养基内,然后倒置于 28~-30°C 生化培养箱中培养一定时间:细菌 1~-3 天,放线菌 10-~14 天,真菌 3~-7 天。

⑥培养结束后,取出培养皿计数。

(2)稀释培养法

一系列稀释度的制作与稀释平板法相同。根据各类微生物在土壤中数量的多少选择适当的稀释度,分别接种 1 ml 稀释液与制作好的液体培养基中,根据需要做 3~4 次重复,适温培养。2 三大类土壤微生物培养基的分离三大类土壤微生物的分离采用稀释平板涂抹法,每个菌种要求做 3 个稀释度,每个稀释度做3-4次重复,选取细菌和放线菌的菌落在20~-200之间的培养皿、真菌的菌落在 10-~100 的培养皿计数,并计算三次重复的平均值。每克干土中微生物数量计算式:

每克干土中菌落数=(菌落平均数×稀释倍数×100%)/(湿土质量×干土)

1, 细菌:牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 3g、蛋白胨 5g、琼脂 18g、蒸馏水 1000 ml、pH 值 7.0-~7.2 。

2, 放线菌:改良高氏 1 号培养基:KNO3 1g,FeSO4·7H2O 0.01g,K2HPO4 0.5g,淀粉 20g,MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、琼脂 18g、3%重铬酸钾溶液 3.3ml、蒸馏水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4

3,真菌:马丁氏培养基(虎红琼脂):蛋白胨 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、琼脂 18.5g、孟加拉红 0.033g、氯霉素 0.1g、蒸馏水 1000ml。

所有培养基需在湿热灭菌锅中121°C灭菌 20-~30min

以上土壤微生物测定方案仅供参考，可以查询专业公司进行检测。

Ⅷ 如何调查土壤中微生物种类

真菌类

存在种类庞大且多样。人类仅了解当中极少部分真菌类的作用，其他的几乎不清楚。

放线菌类

具有分解霉菌等有机物的能力。多半属于制造抗生物质的菌类，有抑制病原菌的作用。

丝状真菌类

也就是种类超过10万种的霉菌。已知极少部分的丝状真菌是导致蔬菜生病的病原菌。

藻类

除了水中之外，有许多种藻类也存在在土壤中。有些藻类会吸收空气中的氮。

蚯蚓

蚯蚓能吃下含有腐殖质的土壤然后排泄出来，是耕土促使土壤团粒化的帮手。

蜱螨类

小于1MM的土壤动物。土壤列存在许多会捕食、会寄生的蜱螨类。

原虫类

移动捕食并且分解有机物的单细胞原生动物，，草履虫、眼虫藻等的伙伴。

线虫类

小于数毫米的微小土壤动物。种类很多，寄生在蔬菜根的仅仅是很少一部分。

甲螨

0.2~1.5mm的小型草食性土壤动物，也是土壤里最多的土壤动物。通过分解落叶为生。

跳虫类

小于数毫米的土壤动物，分解霉菌、藻类为生。被称为“大地的浮游生物”，是物质循环的重要角色。

Ⅸ 如何从复杂的土壤样本中分离我们所需要的目标微生物

如何从复杂的土壤样本中分离我们所需要的目标微生物？
有机肥之中有机质的分解转化是一个复杂的过程，微生物活动在分解转化过程之中起着重要作用。土壤环境非常适合微生物活动，所以土壤之中天然微生物数量最多。因为土壤之中微生物种类繁多，数量大；一克土壤之中，微生物有几十种到几百种，几亿到几十亿个，土壤微生物繁殖迅速，在有机质的转化和分解之中起着重要作用。土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌和藻类。

（1）细菌



细菌是一种单细胞微生物，是土壤之中分布最广、数量最多的微生物。细菌有三种基本形态：球形、杆状和螺旋形；有球菌、杆菌和螺旋体（40种）；包括号菌&41；三种类型。土壤细菌按其营养类型可分为自养菌、兼性自养菌和异养菌。

（2） 真菌



土壤真菌分布广泛，适应广泛的酸性条件，在PH4.0条件之下生长良好，对森林土壤有机质的转化起着重要作用。土壤真菌是异养的。它们必须从土壤有机质之中获取能量和碳源，并在发育过程之中需要良好的供氧。根据真菌与树木的关系及其营养类型，真菌可分为腐生真菌、寄生真菌和共生真菌。

（3） 放线菌



放线菌是细长的菌丝体，呈分枝状或放射状。它们在土壤之中仅次于细菌。大多数是腐生植物。许多放线菌能分解纤维素、淀粉、脂肪、木质素和蛋白质。

Ⅹ 土壤微生物的新方法

用生物化学技术能快速地检测土壤酶活性，使土壤酶学研究在60年代后期至80年代比较热门，其中尿酶、磷酸酶、脱氢酶在土壤中的含量和变化规律研究较多。但土壤酶测定方法用于土壤微生物研究的一个致命弱点是不能直接的反映土壤实际微生物状况。Visser等对酶检测用于土壤微生物群落和土壤质量评价提出了怀疑。Skujins(1978)认为脱氢酶本身的生物化学特征决定了它不可能以胞外酶状态存在于土壤中。为了解决土壤酶测定中的评判问题，Beck（1984）提出了土壤微生物如微生物量（microbialbiomass）、还原酶（rectase）、水解酶（hydrolase）的适宜指标，然而，这些指标从来没有被广泛采用。Beck（1984）和Trasar-Cepedaetal.（1998）认为把酶用于土壤质量评价指标是值得怀疑的，而且缺乏常规可行的酶测定手段，存在药品昂贵等问题[7，8]。
Community-levelphysiologicalprofiling(CLPP)是由GarlandandMills（1991）提出的另一种酶分析方法，微生物群落降解95种不同单一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOGGN微平板较多应用于研究土壤和环境微生物区系。作者采用BIOLOGGN微平板培养分析施用生态有机肥对土壤微生物多样性和番茄青枯病的影响，结果表明，连作地施用生态有机肥后，番茄青枯病显着降低，土壤微生物多样性显着提高。由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解四氮叠茂，此方法只能检测微生物群落细菌（主要是革兰氏阴性菌）中快速生长的那部分微生物信息。不同的微生物对同一碳源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一碳源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对野轮搜碳底物实际利用能力的改变，同时在温育过程中存在适应性问题如代谢补偿、代谢适应等。但CLPP方法因快速、简便而受到人们的欢迎，因而有专用于土壤和环境微生物生态研究的生态微平板（EcoPlates）（Insam，1997）。土壤酶测定方法至今没有一个标准的参数和测颂历定标准，不能对土壤微生物生态功能一个准确的答案，若要充分分析土壤特征，了解不同土壤之间的差异，一定要与其他的方法相配合。 土壤微生物是土壤生态系统桐漏中库（pool）和流的一个巨大的原动力。土壤酶测定一般要在适宜的条件下测定，不能作为土壤物流的原位评价。库和流的计算对土壤微生物学家来说很重要，测定土壤微生物呼吸（CO2的释放量），是较好的微生物群落总代谢活性指标。
N、NO3输入引起土壤酸化，甚至引起地下水的N污染。氮的分配（N2O、NO等）对气候变化和臭氧层破坏有极大影响，生物固氮对缓解矛盾有重要的意义，同时也提高农作物产量和减少人类饥饿。从1970年以来，共生和非共生固氮研究很热烈。土壤微生物学家应用分子生物学技术在转基因作物和转基因工程菌方面研究，大大提高了生物固氮效果。许多传统方法，如N矿化测定，硝化潜力或用于反硝化测定的乙炔抑制方法仍然广泛使用。应用15N放射性标记方法可详细地了解土壤中或土壤微生物群落中的N分配和去向。
土壤具有复杂的空间异质性，大多数养分流测定方法不适于田间测定，局限于实验室模拟，目前有较好的地理信息系统软件来统计和分析这些数据。Bruckner等（1999）测定土壤理化和生物指标，研究了温带松果类森林土壤的的空间差异，发现土壤中某些养分转化过程需要在一定的生态点进行，如仅在一定团粒粒级范围内进行。Rasiah等（1999）研究发现不同农业措施会引起土壤紧实度、质地和有机质特性变化。Stenberg等（1998）研究26种不同性质土壤的微生物状况，也证明土壤有巨大的异质性。