① Realtime PCR如何减小复孔误差值为什么我前后两次对同一批次的cDNA进行的realtime PCR差异很大
两次的差异大,可和梁能是cDNA的保存问题,一般保存在-20度,但是时间长了就会有所降解.
如果降解了,你再做,相对表达量就会降低.
至握胡于复孔之间的差异,我到觉得不是很大,0.5以唤皮运内可以了,已经RT-PCR只是一个半定量的方法.
② qrtpcr数据三个重复如何处理
首先建议生物学重复和技术重复保证三个左右，如果样本只有两个donor，可以将两者混匀后作为第三个样本李历。三个技术重复可以更加确保你数据的准确性。
－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。经内标基因均一化处理后，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△CT=0，而2^0=1。所以根迟游据定义，未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的哪旦搜样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2－△△CT。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。
③ 做PCR的时候为什么同样的东西同样的操作，结果就是会不一样呢，有时候连带都不出，
首先，确唯戚认你的引物和模版，buffer和Taq酶没有拿错别的
其次，你的引物和模版是如何保存的？会不会因为保存不当而降解了。具体方法就是拿别人的模版或者已知有效的模版再做一次，如果是质粒，可以直接抛个电泳，如果是cDNA之类的，可以用让凳GAPDH之类的做一下看看
第三，用别的仪坦山旅器做一个对照，看看仪器的升降温是否出了问题
④ 生物学上对同一组实验若两次实验结果偏差较大应如何处理
先看趋势，如果趋势一致直接算平均值，在生物雪森键上基本上每次的宏弯取样以及样本蔽春闷的状态都会影响实验结果，一般都是多做几组，去掉偏差值，然后算平均值和SD如果SD好大那就算SEM，反正取最漂亮的结果上图
⑤ real-time PCR复孔间的重复性差怎么办
学习做Realtime PCR, 实验结果顷镇旅是出来了,得到的内参、目的基因的Ct 值在15-25 之间,熔 融曲线基本上也是单峰,但不太会处理这个结果,对旅喊着数雀凳据发愁.不同的处理方法得到不 同的结果. 做的是相对定量,SYBR Green, 选用2^（-△ △ Ct）法 内参基因：对照。
⑥ 宏基因组测序对样品的生物学重复有什么要求如何避免重复性较差的问题出现
土壤、水体等生态环境样本建议5个或5个以上的生物学重复；取样时每个样品均需多点取样后混匀，降低单个样本特异性。
人和动物样本因个体特异性较大，建议10个以上生物学重复；肠道、瘤胃或粪便样本因含有较多厌氧菌，要快速取样、迅速低温保存，针对较难富集微生物的样品，如各种物体表面，可采用缓冲液洗脱或棉签擦拭等方法。
样品取好后避免长时间放置，需尽快进行DNA提取，送样测序。
⑦ 临床pcr测定的重复性不好的原因有没有实验室被扩增子污染
核酸检测技术有诸多优点，但由于其超高的灵敏度，一旦实验室出现核酸污染，很容易导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。
因此了解核酸污染原因和清除核酸污染是分子检测实验室的工作重点。
一、核酸实验室污染的产生
在新冠病毒核酸检测过程中 ，常见以下几种污染类型 ：①标本污染；②试剂污染；③ 产物污染；④ 设备污染；⑤ 其他污染。
实验室应发现污染其解决措施：
①标本污染：重新采样进行检测，评估标本前处理环节；
②试剂污染：更换新的试剂重新检测评估；
③设备污染：设备整体消毒清洁、维护；
④产物污染：全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品。
实验室的污染不可能一次就清理干净，需反复清理验证，直到实验结果能被采用为止。
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在实际工作中，实验室可能会因实验过程的操作造成污染而导致“假阳性”。据其分析，污染来源主要有两个方面：
其一，是扩增产物的遗留污染，在大规模核酸筛查的过程中，由于样本量大、采取的又是“停人不停机”的连续工作方式，每轮扩增检测之间的清洁漏宴可能不到位，同时也无法保证每个扩增管完全密闭，带来“假阳性”返隐银的可能。
其二，检测过程中，样本之间可能会发生交叉污染，比如，阳性样本或者实验室所用的质控品污染了本来为阴性的样本，这也会造成的“假阳性”。
除实验室污染外，“假阳性”的出现也可能是因不规范操作所致。个别实验室包括技术人员没有严格按照规定的工作程序进行操作，这是引发“假阳性”的另一种可能。
二、核酸实验室污染的防控
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
(一) 严格实验室功能分区
目前，实验操作在不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1. 试剂准备区。
2．标本制备区。
3. PCR扩增区及分析区。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。
（二）确保实验室人、物及空气流动
核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区→样本制备区→扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。空气流向应按照从试剂储存和准备区→样本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
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（三）实验操作注意事项
1.实验前安全要求
①实验室工作桌面、台面及地面消毒：应使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精，消毒液不得超过24小时。
②转运桶及标本消毒：转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。取出标本采集管后，应首先检查标本管外壁是否有破损、管口是否泄露或是否有管壁残留物。
③如为采样管为非灭活管，实验室操作人员在进行标本热灭活时，温浴前需旋紧标本采集管管盖，必要时可用封口膜密闭管盖；温浴过程中可每隔10分钟将标本轻柔摇匀1次，以保证标本均匀灭活；温浴后标本需静置至室温至少10分钟使气溶胶沉降，随后再开盖进行后续核酸提取。
2.核酸提取和检测安全要求
标本进行核酸提取和检测时应尽可能在生物安全柜内进行操作。如为打开标本管盖或其他有可能产生气溶胶的操作，则必须在生物安全柜内进行。
3.实验结束后清洁要求
①实验室空气清洁。实验室每次检测完毕后，可采用房间固定和/或可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。必要时可采用核酸清除剂等试剂清除实验室残留核酸。
②工作台面清洁。每天实验后，使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精进行台面、地面清洁。
③生物安全柜消毒。实验使用后的耗材废弃物放入医疗废物垃圾袋中，包扎后使用0.2%含有效氯消毒液或75%酒精喷洒消毒其外表面。手消携禅毒后将垃圾袋带出生物安全柜放入实验室废弃物转运袋中。试管架、实验台面、移液器等使用75%酒精进行擦拭。随后关闭生物安全柜，紫外灯照射30分钟。
④转运容器消毒。转运及存放标本的容器使用前后需使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。
⑤塑料或有机玻璃材质物品清洁：使用0.2%含氯消毒剂或过氧乙酸或过氧化氢擦拭或喷洒。
（三）核酸实验室污染的处理
实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测。
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1.标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时：
立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.标本倾覆造成实验室污染时：
保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时（如大量溢撒时）可用过氧化氢加热熏蒸实验室，剂量为2g/m³，熏蒸过夜；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m³，作用1-2小时；
3.清理污染物时：
严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
因核酸实验室污染后难以清除，有可能造成实验室不能使用的风险。但是如果一旦出现核酸实验室污染，除了上面常规的消毒清洁之外，另外可采用专门的实验室污染去除仪去除实验室核酸污染。
仅供医学人士参考
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