qpcr生物学重复指什么

㈠ 如何来设定转录组测序中的生物学重复

如何来设定转录组测序中的生物学重复

1.区分生物学重复与技术重复
生物学重复：指样本重复，比如3只小鼠，同时做一种处理，就是三个生物学重复。
技术重复：一般是三次实验，比如对一块组织，提了三次RNA，做三次real time。

2.设置生物学重复的意义

由于新一代测序技术的优越性以及高成本，曾一度忽略了“生物学重复”的重要性。但生物学重复对于测序实验的设计以及实验数据的解读和分析都非常重要。

设置生物学重复：
能够消除组内误差：生物学重复可以测量变异程度
增强结果的可靠性：测序的样本数越多，越能够降低背景差异
检测离群样本：异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。
案例一：

注：COX4NB和RASGRP1基因在生物学重复样本中表达值的散点图：

左边红色，COX4NB基因表达值的散点图
右边蓝色，RASGRP1基因达值的散点图
上面一行，测序数据的散点图
下面一行：芯片数据的散点图

COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。结果意味着：不同实验组间 COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。
由此可知，设计的实验如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果；获得的差异表达的基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征。

3.生物学重复设置几个合适？

您是不是有同样的问题：转录组测序是否必须进行生物学重复啊，是否要3个重复，是否可以用3个样品的RNA等量混合代替生物学重复，如果不重复能否发文章…..？一方面是有限的经费，一方面是编辑的质疑；实在很难抉择呀~~~
目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。文章投出之后，遭编辑质疑。那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验，FISH荧光原位杂交，或者是northern 杂交等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，然而考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。
注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取了平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。

4.生物学重复分析结果展示

以公司做项目的经验来看，原核生物以及真菌生物学重复的效果>植物>动物，这是由于动植物个体差异较大所导致。所以动植物在选取生物学重复时，应按照严格的筛选条件进行取样，方可得到理想结果。

㈡ 【一文读懂生物学重复与技术重复】

在RNA-Seq等测序设计中，生物学重复和技术重复，是非常需要注意的问题。

那么问题就来了，生物学重复和技术重复，到底是什么？它们是如何影响我们的实验设计的。

生物学重复 （biological replicate）：可以理解为我们对一个群体进行研究，但是我们不会对整个群体进行检测（考虑到成本和工作量的问题，我们肯定也不会采取这种地毯式的方法），只是抽取群体中的一部分进行检测，用样本来代表总体。

这边样本个数，实际上就是生物学重复数。

技术重复 （technical replicate）：对一个样本的数值进行多次测定。

下表给出常见实验对应重复类型：

Replication这篇文章以测定小鼠肝脏细胞中的某一个gene的表达量为例，展示了什么是生物学重复和技术重复以及如何权衡这两者之间的关系。

分别给出3种类型的重复，分别为：
（1）animal水平的重复
（2）cell水平的重复
（3）技术重复

由上图可以得到，3种不同种类的重复，所计算出来的表达量方差是不一样的，但gene表达量的总方差，可以有下列公式计算得到：

接下来，将总体的重复次数限定，即在满足 的前提条件下，对Var(X)进行计算。

1、当 和 均为1， 为48的情况下，计算出来的Var(X)如下图标记：

这种情况下，只反映了由于cell样品重复和技术重复所引起的基因表达量误差。当n_{A}=1（动物样品数为1），即无法计算由于animal样品数变化，所带来的基因表达量误差。

因此在上述情况下， 就被低估了。

2、当 和 均为1， 为48的情况下

计算得到的基因表达量误差完全是由于技术重复所引起的。因此，如果我们将这种情况下的误差，认定为由生物重复所引起的，就造成了假阳性。

同样地，每一种重复对于真实基因表达量的方差贡献也不是相同的。

因为cell重复和测定技术重复，并是一个独立变量。技术重复本质上是对同一份样品进行测定，数据在这种情况下的变异，完全是由于人为或机器造成的，而cell重复在本质上可以认为与animal样品之间存在相关性，因此也不是独立的。

3、从 的角度，来选择replicate

【标注】 越小，代表对 估计越准确

可以看到的是，当增大animal重复数时， 趋于一个稳定值，该样本对总体的估计达到了一个较为准确的水平，同时 的值也接近于0。

4、从统计检验的角度，来选择replicate

使用two-sample t检验，来判断cell样品的gene表达量方差、动物样品表达量均值之间是否存在显着差异。

下图很明显的一个结果就是，随着 的增加，统计检验的效能得到提升，假阳性也在降低（同时也得权衡 和 ）

对于一组数据来说， 研究对象的生物重复比技术重复更能够反映总体 ，因此在进行实验设计时，最好将实验/测序资源倾向这边，而不是技术重复（除非对技术重复所诱发的影响感兴趣）

[1] 刘小乐老师-哈佛计算生物学与生物信息学
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.

㈢ 【转载】生物学重复与技术重复

生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
重复是实验设计的重要原则之一，实验重复无论对于实验结果的可重复性，还是对于最终实验结论的可靠性，都起着起决定性的作用。
实验重复还可以进一步细分为生物重复(biological replicates)和技术重复(technical replicates)，那么生物重复和技术重复分别是什么？在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
生物重复和技术重复分别是什么？
生物重复：指对同一个处理组中独立来源的重复样本分别进行独立分析，是整个实验的完全重复，如将具有同一基因型的多个细胞株进行独立地测定。由于遗传和环境等因素的影响会引起有机体的个体差异，因此需要采用生物重复的实验设计方法来消除该差异。目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。
技术重复：指对同一样本进行重复地检测分析，例如同一份细胞中抽提的蛋白质进行三次质谱检测，或者对同一RNA-seq样本测序3次。与生物学重复相比，技术重复的测量变异程度较小，从而可以减少实验中的分析变异，将对同一份样本产生高重复性的测量结果 。
简单来讲，生物重复是生物级别的重复，一般都是生物样本的重复。而技术重复，更多的是参数测定环节的重复，一般是对同一生物样本进行多次测定。
进一步分析，其实可以发现生物重复是衡量实验的总波动的（处理组间的差异不列入此处的波动，他们应该称为效应），它包括样本个体间差异和技术重复差异，而技术重复更多的是单纯的衡量参数测量时的波动，如实验操作娴熟程度、仪器稳定性等等。
在一个实验中应该如何安排生物重复和技术重复？
如此说来，对于一个实验来说，如果条件允许的话，最好把生物重复和技术重复做全了？
然而StatQuest推荐的策略是只需要生物重复即可，不需要技术重复。为什么？
只做生物重复
以小鼠的RNA-seq实验为例，先看一下生物偏差（biological variation）和技术偏差（technical variation ）。
下图代表小鼠的RNA-seq数据，虚线μ是总体小鼠的Read Counts，蓝色条代表5个样本小鼠的Read Counts。那那么样本小鼠的Read和总体μ是存在一定的差异的，我们将5个样本小鼠的Read取平均：
average = [(μ+5)+(μ-1)+(μ+4)+(μ+2)+(μ-5)] / 5 = μ + (5-1+4+2-5)/5
随着生物重复的增多，(5-1+4+2-5)/5会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体搜咐均值μ。

刚才只考虑了生物生物偏差，没有考虑技术偏差，下图中添加悄灶了技术偏差，棕色条为生物偏差，绿色箭头为技术偏差，那么此时依然可以取5个样本小鼠的Read平均：
average = μ + (5-1+4+2-5)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着生物重复的增多，生物偏差(5-1+4+2-5)/5 逐渐趋向于0，技术偏差也会逐渐趋向于0，这个平均数也会趋近于总体均值μ。
所以只做生物重复就可以很好的使用样本代表总体。

只做技术重复
继续进行实验，下图代表对1#小鼠测定了5次RNA-seq数据。那么同样方法取5个RNA-seq数据的平均：
average = μ + 5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着技术重复数的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋近于0，而这个平均数会逐渐趋近于μ + 5，永远也不会等于总体均值μ，因此做再多的技术重复，最终的RNA-seq数据也无法很好的代表总体。

同时做生物重复和技术重复
以下图为例，1#小鼠做了2个技术重复，2#小鼠做了3个技术重复，此时的生物偏差为5、5、-1、-1、-1，而技术偏差不变（技术偏差是参数测定时的偏差，不会因样本而异，而且因样本而已的偏差肯定是样本偏差），所以样本均值为：
average = μ + (5+5-1-1-1)/5 + (-2+5+2-2-1)/5
随着样本量启漏扮的增加，技术偏差(-2+5+2-2-1)/5会逐渐趋向于零。
但生物偏差(5+5-1-1-1)/5虽然也会收敛到0，但是此时所需要的样本量比‘只做生物重复’时大大增加，也就是说生物偏差的收敛速度变慢了。

这个生物偏差收敛变慢的速度有多慢呢？
假如多了3个技术重复，那么就需要3倍的样本量才能抵得上‘只做生物重复’时的收敛速度。说白了，就是多做的技术重复最多不过和‘只做生物重复’的效果持平而已。

做一下总结：
只做生物重复：最佳的实验设计，可以很好的代表总体；
只做技术重复，没有生物重复：不要使用这种实验设计，永远只会得到总体的有偏估计。
生物重复和技术重复：不推荐做，并不能很好的提高样本的代表性，要么获得一个有偏的估计，要么需要更多的样本。

㈣ qpcr是什么

qPCR（）是一种利用PCR技术定量检测DNA或RNA的方法。它是PCR技术的一种改进，可以快速、准确地检测DNA或RNA的数量，并且可以检测非常少量的样品。
qPCR的原理是在PCR反应中，通过定量检测PCR扩增的DNA或RNA的数量，来推断初始模板的数量。在qPCR实验中，通常会加入一种荧光染料，这种染料在PCR反应中与扩增的DNA或RNA结合，产生荧光信团袭号。通过检测荧光信号的强度，就可以推断出模板的数量。
qPCR技术广泛应用于塌脊兄医学、生物学、生态学、农业等领域，例如检测病原体、评估基因表达和基因型、检野稿测环境中的微生物等。

㈤ 请问什么叫QPCR

QPCR 问：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：第一代产品：基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。第二代产品：基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。第三代产品：实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？答：QPCR至少有以下特点：所用仪器少，只用一台仪器。检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化，如图一所示： 图一 西安天隆TL988实际曲线1检测动态范围：10～10000000000 DNA copies/ml检测精度：0.1RLU辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7％。问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，沙眼衣原体，Neiserria gonorrhea(NG)，性传播疾病，淋病双球菌，Cytomegalovirus（CMV），性传播疾病，巨细胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，结核分支杆菌等。实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如美国ABI/7700-120万元，美国ABI/5700-50万元，瑞士Roche/Lightcycler-70万元，美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元 可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。 国产仪器情况：国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪（48孔） 以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在45万以上。 国产试剂情况：多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV，优生优育系列：巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。 编辑词条 开放分类：病毒、DNA、PCR、分子生物、实时荧光定量PCR仪 参考资料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 贡献者：zhang120jing、弦之月NONO

㈥ qpcr是否一定要有生物学重复

要的。
首先qPCR不是很准，特别是对于新手来说。
其次，三个平燃纤行以上才具有统计学皮首仿意义，三个生物学重复以上才具有生物学意义。（芹乱发表文章时需要）