Ⅰ 怎样将微生物菌落分析的宏基因组数据上传到NCBI上
宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是： 对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。
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临床微生物检验的快速诊断技术研究进展
关键词：分子生物 来源： CHKD期刊全文库《当代医学》2099年第16期
（本文作者：解放军第二五二医院 李苏利）
目前感染性疾病仍然是危害人类健康的重大隐患。随着新发和突发感染性疾病的涌现，曾已被控制的感染性疾病的卷土重来，造成感染性疾病的微生物种类日益复杂，常见的病原微生物的威胁不仅没有消除而且出现了大量耐药菌株，加上新的病原微生物的出现，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰。严峻的现实给病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。世界卫生组织(WHO)对临床微生物实验室提出:临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面。利用一切手段将实验室数据转化为临床有用的信息。
1 自动化鉴定技术的应用
临床微生物的实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，尤其是分离培养，目前仍然是许多病原体检测的“金标准”。但是，由于细菌的生长繁殖需要一定时间，使检测周期难以缩短。此外，很多病原体的培养受营养要求、抗生素应用及病原体含量等因素的影响，用传统人工方法操作复杂、检测周期长，敏感性与特异性也有限。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，随着计算机的发展和应用，先后出现了许多自动与半自动细菌鉴定与药敏系统，统称为“微生物鉴定专家系统”，这些系统大大提高了临床实验室的工作效率和检测的准确性，传统鉴定方法也在逐步改进，并在一定程度内加快了检测速度。
2 免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术。
2.1 凝集技术 常用的凝集技术有乳胶凝集技术和血清凝集技术。用于微生物的初步诊断、分型、鉴定，例如霍乱弧菌和志贺菌的分型，大肠杆菌O.57：H7、脑膜炎球菌等，短时间内就可完成鉴定。该诊断法具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。
2.2 荧光抗体技术 荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，把荧光素作为抗原标记物，在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快。吕治林等报道由美国同行所作的用炭疽杆菌细胞壁(CW-DFA)和荚膜抗原(CAP-DFA)特异的荧光标记的单克隆抗体，可快速鉴别炭疽杆菌。
2.3 酶免疫技术 酶联免疫技术现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测，可检测样本中病原体抗原，也可检测机体中的抗体成分。应用单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点ELISA技术，已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。Gehring等用酶联免疫化学发光法(ELIMCL)测定大肠杆菌O.57：H7。许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。
3 分子生物学技术
随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域，为科学快速发展提供了新的机遇。
3.1 PCR技术 PCR具有高度敏感性和特异性，在病原体检测上，对形态和生化反应不典型的微生物鉴定，常规方法常难以准确检测，即使出现大量死菌PCR也能做出准确的鉴定；不受混合标本的影响，可轻易从含有大量正常菌群的标本中鉴定病原菌；对于生长缓慢或难于培养的微生物鉴定，如分枝杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、螺旋体等，目前其他方法阳性检出率很低，PCR技术对这类菌株的鉴定有重要意义。
但是常规PCR技术也存在一些问题，如出现假阳性、形成引物二聚体，检测操作也比较繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果。为了克服这些不足，一些新的PCR技术渐衍生出来并被用于实践，如巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR(UP-PCR)、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA多态性扩增(RAPD)、限制性长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR等。
3.2 基于16S rRNA与GyaB的检测技术
3.2.1 以16S rRNA为靶基因进行检测 16S rRNA存在于所有原核生物细胞中，它们相对稳定且有较高的拷贝数，其序列中含可变区及高度保守区，因此可设计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见细菌的16S rRNA基因几乎全部测序完成，16SrRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。
3.2.2 以促旋酶(g yras e)B亚单位基因靶基因进行检测GyaB除了具有16S rRNA所具有的优点外，其基因进化率高于核糖体基因，还有GyaB在近乎全部细菌中呈单拷贝形式。有研究表明，基于GyaB序列构建的进化图谱与基于DNA-DNA杂交的相一致。因此，GyaB的分析特别适合于菌株的区别和鉴定。Fukushima等以GyaB基因为靶基因设计基因芯片来检测分枝杆菌属，实验结果显示此芯片鉴别分枝杆菌达到种水平，并且能区别密切相关的菌种，这对临床治疗具有重要的参考价值，说明分析GyaB基因序列对于在菌种水平鉴别细菌是快速而有效的方法。
3.3 多位点序列分型 多位点序列分型(MLST)是近年来发展很快的分子生物学分析方法，具有很高的分辨能力，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学的研究。MLST越来越多地被作为能进行国际间菌株比较的常用工具，建立一种更为准确的分析系统方法，并且用于研究出现的不同的抗生素抵抗株，相关特殊基因型及新的变异株引起的疾病流行病学分析和种群结构的研究。
3.4 环介导等温扩增技术(LAMP) 环介导等温扩增技术(LAMP)，是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统方法相比，不需要热循环为等温扩增，且由于反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果。因此LAMP是一种不需要热循环仪、肉眼即可判定结果的高度特异和敏感的DNA扩增方法。该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换聚合酶在恒温条件(65℃左右)保温约60min即可完成核酸扩增反应，扩增出特征性梯状条带。还可通过设计两条环引物可使反应速度提升1/2～1/3。LAMP技术可用于病原微生物的现场快速检测、战时野外及基层普及应用。
4 分子生物传感器
分子生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术，是现代临床诊断发展的一个新方向。由于生物传感器检测准确、操作简便等特点，近年来已经在许多领域取得了很大的进展，在感染类疾病诊断、药物筛选、未来战争生物战剂监测等领域获得了广泛的应用，其中临床中用于病原体检测的以DNA生物传感器最为常见。华裔科学家陈建柱最新制成的生物传感器，仅需20s时间即可检测出微量SARS病毒、天花病毒及炭疽杆菌等的存在，从而达到早期诊断的目的。
5 基因芯片
基因芯片是高通量的群体指标分析系统，基因芯片技术是一项全新的技术，它以一次性检查上万个基因的优势，被誉为是基因功能研究中最伟大的一项发明。它以许多特定的寡核苷酸片断或基因片断作探针，有规律地排列、固定在诸如硅片、 玻璃片、尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，以达到一次试验同时检测多种疾病或多种样品的目的。基于高通量、微型化和平行分析的特点，基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测和基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。目前，许多细菌、病毒等病原体的基因组测序已经完成，将许多代表各种微生物的特殊基因制成1张芯片，经反转录就可检测样本中有无病原体基因的表达及表达水平，由此判断病人感染病原、感染进程以及宿主反应等，这样就大大提高了检测效率。
6 蛋白指纹图谱技术
蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的一种新技术。近年来，越来越多的学者意识到有必要从蛋白质水平来研究微生物。蛋白质是细菌功能的执行者，细菌种类繁多，不同的蛋白种类决定细菌千变万化的功能和特征。1996年，Clayin等采用MALDITOF MS质谱成功鉴定了革兰阴性和革兰阳性细菌，表明不同属种的细菌具有不同的蛋白指纹图谱，同一种细菌具有相似的蛋白指纹图谱，根据细菌蛋白指纹图谱可对细菌进行快速鉴定。中科院微生物所唐宏研究员等利用“蛋白质质谱指纹图谱”最新技术及其检测办法，可以分析得出SARS与非SARS病人血清中的蛋白质成分变化。这种检测SARS病毒方法经北京天坛医院临床证实，阳性率接近95%，特异性将近96%，能在病人发烧的第一天即可以得出满意的检测结果。有专家称蛋白质指纹图谱技术标志着一种划时代的诊断模式的诞生。
随着计算机技术的不断发展，临床病原菌检测将向着高度自动化和开发简便的快速检测技术两个方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器的使用，将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面发挥巨大的的作用。随着多学科交叉时代的到来，最终将彻底改变临床病原菌检测的现状和传统观念，实现高效高质、快速统一。
Ⅲ 转录组测序所得的数据，怎样传到NCBI的SRA数据库
xshell连接NCBI服务器 输入命令 ftp
连接成功后输入账号 密码
mkdir命令创建一个文件夹，以你的BioProject accession命名
FTP 连接成功后连接成功后
进入刚才建立的BioProject文件夹
把原始数据拖进去即可
传输过程中，如果一定时间（五分钟？）没有激活传输界面，可能会导致连接断开
进度可能会一直停在99%，重新连接成功后，也一直卡在99%，不过似乎数据还是上传成功了的
传输成功的会显示linked，同时FTP里对应的文件会消失 传输成功的会显示linked，同时FTP里对应的文件会消失
全部文件夹都传输成功了会变成queued
然后就等NCBI处理了
Ⅳ 环境微生物测序采样指南
随着高通量测序技术飞速发展，人们对微生物的认知也在逐渐深入。凌恩生物每天都会接到全国各类型微生物测序样本，上到山巅土壤，下至深海底泥；有老师研究植物根际和叶内微生物，也有老师关注动物昆虫肠道生理代谢的奥秘。为了得到能够研究的测序结果，规范标准的取样及送样是成功的前提。
在样本送测前，我们要注意以下几点：
1、取样使用的工具及容器必须经过灭菌处理；
2、取样后及时做好标记，记录取样相关信息；
3、样本送测前做好备份，防止意外发生丢失珍贵样本；
4、送测样本使用标准容器承装，在容器上标记清晰，送样不宜过多；
5、寄送时保持低温环境，建议使用干冰配送；
6、可使用凌恩微生态样本保真液，高品质样本是决定高品质研究成果的第一步。
常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤等
(1) 取样方法
按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质，根据需要挖取相应深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰磨拍掘上运至实验室。去除可见杂质，建议过2 mm无菌筛网。同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g，保存无菌EP管中，进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司。
注：建议戴一次瞎核性手套、口罩，进行严格贺敬取样和操作，尽可能减少人为的污染。
根际土壤样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等
（1）作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法
a. 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室；
b. 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤；
c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
（2）林木类根际土壤取样方法
a. 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室；
b. 过 2-5 mm 孔径无菌筛网；
c. 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。
注：取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤，请务必尽可能去除菌丝体残留，减少对 DNA/RNA 提取的干扰。
植物表面微生物取样方法
（1）取样方法
依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。植物根部组织可以通过摇晃振荡或无菌刷子去除根表粘附土壤。
（2）样本前处理
将植物组织浸没于无菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，超声波洗涤10min（参数：160 W，30s/30s），最后取出植物组织至于-80度冰箱保存备用。
将三次洗涤液汇总，过0.2um滤膜（或12000g离心10min，收集沉淀），收集滤膜至于-80度冰箱保存。
植物内部微生物取样方法
（1）依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。
（2）对植物组织进行表面消毒操作或者使用上一步“ 植物表面微生物取样”中处理过的植物组织，液氮速冻后，研磨成粉，即可用来进行核酸的提取。
植物组织表面消毒具体操作如下：
无菌水洗涤30s，70%无菌乙醇洗涤2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min后转移至70%无菌乙醇浸泡30s，最后使用无菌水洗涤植物组织3次，即视为对植物组织表面进行无菌化。
表面无菌化的植物组织至于-80度冰箱保存备用或进行核酸提取。
植物根表面微生物取样方法
（1）将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中；
（2）加入PBS缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上；
（3）直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。
PBS浓度和PH有要求：浓度是用1x的，PH值是7.4，一般买回来的PBS是10x的，建议稀释到1x。
注意： 建议优先使用超声波洗涤 。
空气样本微生物取样方法
使用空气抽滤机，使空气通过 0.22 μm 滤膜，滤膜上有可见覆盖物（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。滤膜置于冻存管中，液氮速冻，干冰寄送到实验室。
注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。
水体样本微生物取样方法
送样量：扩增子直径3-4cm滤膜1-2张；宏基因组直径3-4cm滤膜>=2张；
（1）研究目的进行确定水体的取样深度和范围；
（2）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45μm的滤膜，取样体积大于5L；对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；
（3）水体泥样的采集提供大于5g样本；
（4）用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。
注意：扩增子项目将2-3L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中；宏基因组项目将10L水体过滤到>=2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中。
活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法
（1）活性污泥
从活性污泥装置中取大于10 ml的悬浮污泥样本（约5-10 g沉降物），保存无菌EP管中，放入液氮或置于冰上，立即运至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。
注：若液态污泥样本沉降物较少，可适当增加取样量。
（2）水体/地表沉积物
取距离水底/地表0-10 cm（具体按实验需要而定）的沉积物5~10 g，保存无菌取样袋或EP管中，置于冰上运送至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。
Ⅳ 美吉微生物多样性中如何上传自己的环境因子
首先，登录NCBI主页面后点击Submit进入到数据上传页面，然后选择SRA数据库点击GO按钮后接着点击New submission；
第二步：填写提交人的个人信息和单位信息；
第三步：填写BioSample、BioProject和数据释放时间（之前没有创建BioSample、BioProject可以选择NO）；
第四步：项目信息填写，根据实际情况填写（带有*号的为必填，其它可以不填写）；
第五步：样本类型选择；
第六步：样本具体信息，需要我们下载表格填写，表格中绿色的为必填，蓝色的需要至少填一个，其它内容可以选填或者不填写，如果是生物学重复需要添加一列replicate,填写完成后需要将信息粘贴到文本文件中（TXT格式），然后上传到网站上；
Ⅵ biolog微生物鉴定系统
Biolog微生物鉴定步骤
一 检测原理
Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二 所需器材和消耗品：
培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三 鉴定步骤：
Biolog微生物鉴定样品处理步骤
分离纯化培养基
BUG+B
通用培养基加羊血
BUA+B
厌氧培养基加羊血
BUY
酵母培养基
2%ME
2%的麦芽汁提取物
革兰氏染色和菌落菌株形态观察
革兰氏染色结果
革兰氏阴性
革兰氏阳性
厌氧菌
酵母菌
丝状真菌
确认实验
氧化酶反应阳性
氧化酶反应阴性、三糖铁实验A/A或K/A
需在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养
确认实验
氧化酶反应阴性、三糖铁实验K/K或K/Aw
微生物类型
GN-NENT
非肠道菌
GN-ENT
肠道菌
GN-FAS
苛生菌
GP-COCCUS-ROD杆球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD杆菌
GP-ROD
（芽孢杆菌）
AN
厌氧菌
YT
酵母菌
FF
丝状真菌
扩大培养基
BUG+B
BUG+B
巧克力培养基
BUG+B
BUG+M+T
BUA+B
BUY
2%ME
培养温度
30℃
35-37℃
35-37℃
35-37℃
30℃
35-37℃
26℃
26℃
培养气体
空气
空气
6.5% CO2
空气或6.5% CO2
空气
无氢气的厌氧环境
空气
空气
接种液类型
GN/GP-IF
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF
AN-IF
水
FF-IF
接种浊度/
浊度标准管
52%T
GN-NENT
61%T
GN-ENT
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
28%T
GP-ROD SB
65%T
AN
47%T
YT
75%T
FF
鉴定板类型/
每孔菌悬液的量
GN2
150μl
GN2
150μl
GN2
150μl
GP2
150μl
GP2
150μl
AN
100μl
YT
100μl
FF
100μl
培养时间（小时）
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
20-24
24,48,72
24,48,72,96
第一步：
在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。
如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。
微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。
微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。
如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。
第二步：
首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。
在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。
按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。
调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。
将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。
第三步：
将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免造成上方漏气。吸取菌悬液，观察每个移液器头中的液面是否一致，如果不一致，放出菌悬液，加固移液器头。加完菌悬液后，盖上盖子。
第四步：
培养环境根据所鉴定的菌株种类而定。准备一个塑料容器，在底部铺上湿纸巾，把鉴定板放在纸巾上，可以防止鉴定板外缘孔水分的蒸发。对于革兰氏阴性阳性菌，鉴定板培养4-6个小时可以进行一次读数，过夜培养（16-24个小时）可再进行一次读数。厌氧菌在培养20-24个小时后进行一次读数即可。酵母和丝状真菌所需培养时间稍长，一般间隔24个小时读一次数。
第五步：
开启读数仪和电脑，打开Biolog软件，并对读数仪进行初始化，设置好各项参数（培养时间、菌株名称、菌株编号、菌株类型），用纸巾擦干净培养好的鉴定板底部，放入读数仪，A-1孔位于左上方。即可点击“Read This”进行读数。鉴定结果自动显示在屏幕下方，将所得数据进行保存即可。