① 生物上基因诊断的步骤是什么
1、核酸杂交:酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。其基本过程包括下列几个步骤。
(1)制备样品:首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段,然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱,所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后,直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离,然后转印并交联固定。
(2)制备探针:探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中,探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样,通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子,既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置,也就是在电泳凝胶上的位置,也就知道了它的分子大小。
(3)杂交:首先要进行预杂交,即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子,所以杂交过程中只需变性标记好的探针,再让探针与膜在特定的温度下反应,然后洗去未结合的探针分子即可。
(4)检测:检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。
② 如何鉴定DNA和RNA(生物)具体做法
高中粗鉴定:用吡罗红(DNA)和甲基绿(RNA)鉴定.
DNA的鉴定
(1)配制二苯胺试剂:取0.1 mL B液;滴入到10 mL A液中,混匀.
(2)鉴定:取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝).用沸水浴(100℃)加热10 min.在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色).
附1:研磨液的配制方法
Tris:10.1 g(相对分子质量为121.4),先加50 mL蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 mol/L的盐酸调至pH=8.0,再加下述药品.
NaCl:8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA:37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS:20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定溶至1000 mL.
若在室温低于20℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解.如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用.
附2:研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离.
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA.
物质的量浓度为0.15 mol/L的氯化钠溶液:能很好地溶解DNA.
Tris/HCl:提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态.(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
RNA的鉴定
取RNA沉淀约O.2 g,加2 ml 10%H2SO4→沸水浴中加热2 min→加1.5 ml地衣酚试剂→沸水浴中加热→观察颜色变化。