如何防止微生物菌种的退化

‘壹’ 防止菌种退化的措施有哪些

（1）减少扩接食用菌的退化、种性变异，是在繁殖过程中发生的，常用控制菌种移接次数来防止。生产中，应减少菌种扩接次数。当获得优良菌种后，其转管扩接最多不超过5次。（2）防止基因突变可用低温保藏菌种，一般在0～4℃之间。目前国内外公认防止菌种退化的方法是在液态氮超低温条件下保藏菌种。（3）分离纯化对保藏的优质菌种，需要经常分离纯化。一般每次生产出菇后，都应挑选符合本品种特征的优良子实体，进行组织分离。每年进行1次孢子分离，经出菇鉴定后，选择性状优良的再进行组织分离。总之，有性孢子分离与无性组织分离要交替使用。用有性繁殖来发现好的变异菌株，用组织分离来巩固这些优良菌株的遗传特性。（4）菌种复壮复壮只能使菌种恢复健康，而不能使其恢复年轻。当某一菌种因环境条件不适宜，生产发育不良时，给予它适宜的条件，菌种比原来长得旺盛起来，就叫复壮。复壮的措施很多，诸如选择该菌种适合的培养基、培养温度、环境、pH、防止杂菌污染及避免多品种混合栽培等。（5）添加维生素E在培养基中加入维生素E，可防止菌种衰退。方法是：马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装试管后，每管用针筒注入1粒维生素E胶丸溶液，再按常规灭菌、制作斜面和接种。（6）改善环境三级菌种培育过程，都必须创造菌丝生长最适温度进行培养，人为控制低温或高温，并注意培养室空气的更新，以及室内外清洁卫生，不断创造良好的生态条件。

‘贰’ 微生物菌种保藏的方法有哪些

菌种的优劣是食用菌生产成败的关键。菌种是国家重要的生物资源，也是微生物工厂首要的生产资料。由于微生物繁殖快、易变异，因此微生物菌种特别需要妥善保藏。世界各国对微生物菌种都很重视。中国科学院微生物研究所专门设立了菌种的保藏机构，为各生产单位收藏和供应各种优良菌种。当然就具体的生产单位而言，大量的生产用菌种还得靠自己来生产和保藏。
菌种保藏的目的：是使优良菌种经过较长时间后，仍能保持菌种的优良性状、生活能力及纯度，降低菌种的衰亡速度，确保菌种的纯一，防止杂菌污染及绝种。
保藏菌种的方法：人们在长期的生产实践中，积累了不少保藏菌种的经验，常用的保藏方法有：斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法、滤纸片保藏法、谷粒保藏法等。常用保藏菌种的方法有以下几种：
（1）斜面低温保藏法这是最简单最普通的保藏方法。首先将菌种在适宜的斜面培养基（一般PDA）上培养成熟后，选择菌丝生长粗壮，边缘保存。一般保存温度4～6℃，除草菇和银耳菌种外（10～15℃），此方法对其他食用菌都适宜，一般菌种可保藏2～4个月，所以需定时移接。此法保藏虽然方便，但是保藏时间短，需经常转管，也很容易发生衰退变异现象。因此，不能用作长期保藏，最好与其他方法结合起来保藏。
另外，为了减少保藏期间培养基水分蒸发，琼脂最好加到2.5%。为防止菌种在保藏过程中产酸分的积累，应加入0.2%的磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等缓冲盐类，同时，培养成熟后，最好将棉塞管口外剪平，并用矿蜡封或换以无菌木塞，这样做也可以减少培养基水分的散失，延长保存时间。
在农村如果没有冰箱，可采用土法保藏。即把保藏用的斜面菌种换上无菌橡皮塞，并用矿烛蜡封后密闭的广口瓶中，悬入井底保藏。（2）贮藏室保藏法原种和栽培种一般只在贮藏室短期保藏，贮藏室温度0～10℃为好。室内应清洁、干燥、无光，应经常检查温度和湿度，以降低其生活力，减少变异退化，防止杂菌污染，避免过早出菇。温度越高，保存的时间越短。

‘叁’ 发酵工业对微生物菌种的基本要求

内容如下：

1、能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高且易于回收。

2、生长较快，发酵周期短。

3、培养条件易于控制。

4、抗噬菌体及杂菌污染的能力强。

5、菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定。

6、对放大设备的适应性强。

7、 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

应用领域

微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。发酵工程的应用范围有：

⑴医药工业。

⑵食品工业。

⑶能源工业。

⑷化学工业。

⑸农业：改造植物基因；生物固氮；工程杀虫菌生物农药;微生物饲料。

⑹环境保护等方面。

微生物肥料由一种或数种有益微生物活细胞制备而成的肥料。主要有根瘤菌剂、固氮菌剂、磷细菌剂、抗生菌剂、复合菌剂等。微生物肥料具有增产、改善品质的功能，还有显着减少植物体内硝酸盐，亚硝酸盐和重金属含量，提高化肥利用率以及培肥土壤等作用。要使微生物肥料在无公害蔬菜生产中真正发挥增产增效环保的作用。

微生物肥料是一种 纯天然、无毒、无害、无残留、无污染的高科技生命体。生命力极强，适应各类地质、各类土壤。使用范围极广，可广泛用于水稻、小麦、玉米、棉花、油菜、花生、大豆、芝麻、大葱、韭菜、大蒜、菠菜、洋葱、薯仔、西瓜、南瓜、冬瓜、西葫芦香瓜、辣椒、香蕉、菠萝、荔枝、龙眼、蔬菜、中药材、速生杨、用材林、竹林、花卉、苗圃、草坪等。

‘肆’ 菌种的退化表现在哪些方面如何延缓退化

食用菌的遗传稳定性是相对的，其变异性是绝对的，尤其退化性变异的大量存在，往往使一个优良的菌种，衰退转化成为劣质的菌种，这是菌株的遗传物质发生了可遗传变化的结果。虽然食用菌菌种在适宜的环境条件下可以贮藏较长时间，但是，许多常规的保存方法可能会引起菌株衰退，不当的非专业性的设施、设备和技术操作也常引起菌种的退化和老化。在生产中表现为：

（1）长速减慢

培养期间长速缓慢，特别是在PDA培养基上更加明显。

（2）长速不一

继代培养时，个体间长速差异明显，不能同时完成培养。

（3）长相不一

其继代培养物长相不完全相同，有的菌丝不舒展、有的菌丝边缘不整齐、有的菌丝干瘪、有的菌丝稀疏、有的气生菌丝变少或变多、有的在气生菌丝的顶端出现黄色色素，有的色素分泌到培养基中等。

（4）似非拮抗现象的出现

当在PDA培养基上培养时，出现星星点点的小菌落，这些小菌落不能随菌落的扩展而融为一体，而是两者边缘之间总有都不能逾越的“三八线”，但又不呈现典型的拮抗现象。

（5）其他不良表现

长势弱、成活率和产量降低、菇形变小、畸形、商品性降低、抗逆性和抗杂性下降等。

菌种的退化，是在传种继代过程中，从量变到质变的渐变结果，也是一种病态和衰老的综合表现。对于食用菌的同一个种，或者同一个斜面上的菌丝体来说，经移接培养后形成的菌株，在遗传物质上存在着差异，这种差异会因环境与培养条件的不同出现表型上的变化，加之菌丝个体小，生长快，易受理化及生物因素作用的影响，所以容易引起衰退，这种衰退最初是在群体中个体上发生，如不及时发现，采取有效措施，仍继续移接传代，则衰退的个体在群体中的比例会不断增加，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，我们应该一方面用妥善的保藏方法去延缓或遏制菌种迅速老化和变异；另一方面是给予适宜的环境条件，恢复原来的生活力和优良种性，达到复壮目的。采取下列措施，有助于延缓菌种的退化。

①要防止菌种混杂 在选留种菇，进行出菇试验等工作中，均应加强品种隔离，减少品种间的天然杂交，以保证优良品种的遗传组成在较长时间内能保持稳定。

②加强菌种保藏工作，并适当控制传代次数 传代是一个微生物技术术语，把培养物接种到新的培养基上，以保持该微生物原有性状和旺盛活性的操作叫传代。传代次数是否引起食用菌退化是一个复杂的问题，在微生物工业中，一些优质菌菌种在三代以后的孢子即表现出明显退化；而食用菌的情况不完全相同，次生菌丝从斜面到斜面是传代，属于无性繁殖，稳定性强，由于操作和外界条件的影响，有时产生变异，传代次数多，引起基因突变和发生衰退的几率就越高。所以在生产中，引进或分离纯化得到一个优良品种后，不要立即将该原始种全部用完，而应将其妥善保藏。菌种的传代次数一般不要超过6代。

③警惕菌种可能遭受病毒的感染 确证已感染病毒的，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。病毒感染程度轻的，可以进行脱毒。据许襄中（1994）初步研究，采用挑取尖端菌丝（取染毒菌落尖端3～4毫米幼嫩菌丝）及高温培养（32～34℃）相结合的方法，有一定脱毒效果。关于人工脱毒技术的开发及效果评价，值得进一步研究。

④创造菌种生长的良好营养条件和生活环境 适宜的菌种培养基，能使菌种生长健壮，减少衰退，营养不足和过于丰富都会加快菌种衰退速度。

⑤经常改变培养基的配方成分 在菌种传代保藏过程中，切忌连续使用某一培养基固定配方，这也是防止菌种衰退的一项重要措施。

以上措施无疑都有助于延缓菌种退化的步伐。但是，由于造成退化的因素具有相当程度的普遍性和随机性，因此，任何一个优良菌种都不可能一劳永逸地永远保持优良性状。适时对菌种进行更新换代始终是实现高产稳产的一项根本措施。总的看来，我国常见栽培食用菌菌种的更新换代工作还赶不上生产迅速发展的需要，今后应进一步加强这项工作。

‘伍’ 一支生产性能优良的菌株在斜面保藏过程中,为什么会出现退化

菌株采用斜面低温保藏法时，菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染，所以会产生退化。
斜面低温保藏法：将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长。

‘陆’ 常用的菌种保存方法有哪些

菌种保藏是食用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。

一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此，保存方法应具备取材容易、操作方便、菌种不易退化、长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：

（一）斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是：菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间（2～3个月）转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5%～3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。

斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。

（二）自然基质保藏 此法是根据灰树花的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。灰树花是木腐菌，可以采用以木屑为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。

1.原料与配方 粗、细木屑比例适当，采用板栗树木屑最佳，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1∶2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%左右。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，架空菌丝多；细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用配方如下：

栗木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时取出换上无菌橡皮塞，在0～5℃冰箱内保藏1～2年转管一次。

2.容器与装量 采用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。

3.灭菌和冷藏 灭菌时若采用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好采用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰树花在自然状态下易发生于栗树根部，这说明其营养需求较为特殊。根据灰树花这种习性，在PDA基础上添加适量的栗树木粒制成母种培养基。在多年的使用中发现，用该培养基培养的母种生长势好，在转接原种时，适应能力强，萌发定植快；用作菌种保藏基质时，保藏时间长，并能很好保持菌种的优良性状。

1.木粒PDA的制作 选取栗树边材，加工成0.3～0.5厘米的颗粒，及时烘干或晒干备用。称取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解于1升清水中配制成营养液。将营养液倒入盛有木粒的小铝锅中，营养液以完全浸没木粒为准。煮沸10分钟，以加快木粒对营养液的吸收速度，起锅静置30分钟让木粒吸足营养液。捞出木粒，沥掉表面的水，装入试管，装量为试管长的1/6，最多不得超过试管长的1/5，否则在摆制斜面时，不易使木粒均匀分散于斜面的表面上。

选取新鲜的马铃薯，去皮并切成薄片，称取200克放入小铝锅中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁热过滤取汁，并补足1升的体积。称取琼脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先将琼脂剪碎，加入到马铃薯滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶化。待琼脂完全溶化后，加入称好的其他3种营养成分，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热装入已装有木粒的试管中，装至试管长的1/3处，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸气压下灭菌40分，待气压降至0时，开盖取出，趁热轻轻抖拍试管，使木粒分散后即可摆制斜面，并使木粒呈半裸状分布于斜面上，待凝固后便制成了木粒PDA培养基。

2.生长及保藏效果 木粒PDA斜面上培养的灰树花母种，菌丝生长迅速、良好，12天即可长满试管，但菌丝的后期生长势更为粗壮、浓密，后劲足。转接原种时，菌种适应力强，定植快。这表明，灰树花菌丝的生长速度、生长势不仅取决于本身的遗传性，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分，主要是可溶性的速效性营养，前期营养丰富，营养利用直接，因而前期菌丝生长迅速、良好，后期营养则不足，菌丝生长不良，长势欠佳。木粒PDA由于在增添了木粒这一缓效性营养，就木腐性的灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，因此后劲足。

菌丝体对基质的分解利用是通过菌丝细胞分泌的胞外酶，将基质中的大分子营养分解成小分子营养后才被吸收利用的，而这些胞外酶大多为诱导酶，其合成与分泌受基质的诱导和分解产物阻遏机制调节。就纤维素酶而论，许多易代谢碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同时伴随着菌丝体的旺盛生长，酶的大量合成则出现在易代谢碳源基本耗尽之后，且受到基质纤维素的诱导，常规PDA基质，到葡萄糖等易代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养的缺乏，菌丝生理机能下降，酶的合成量减少。而木粒PDA不仅含有易代谢碳源——葡萄糖，又含有木粒这一缓效性营养，前期葡萄糖促进了菌丝体旺盛生长，获取了大量的菌丝体，表现为菌丝粗壮、浓密。到了易代谢碳源耗尽的后期，木粒一方面补充了后期所需的营养，使菌丝的生埋机能维持在一定的水平；另一方面木粒的纤维素激活菌丝细胞纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰树花较强的分解木材的能力，因此，用该培养基培养的母种在转接原种时适应力强，萌发定植快。因部分菌丝长入木粒内部，抵抗不良环境的生存能力增强，种质不易退化。木粒PDA灰树花菌种，在0～5℃保藏2～3年再转管活化，成活率仍达到90%左右。此外，木粒PDA应用于木腐性灰树花种的提纯复壮，效果也较理想。

（四）石蜡隔氧封藏 具体做法是将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的1/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1～2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。

‘柒’ 菌种保藏的常用方法及特点

（1）斜面低温保藏。是一种最常用、最简便的菌种保藏方法。首先将需要保藏的菌种接到斜面培养基上，在适宜的温度条下培养，当菌丝健壮地长满斜面时，即将此试管菌种取出，放置于4 ℃的冰箱中保藏。特点：
①简单易行，适用于各类菇类菌种保藏，是目前生产及科研普遍采用的一种方法；②保藏时间短，需6个月转接一次，转管次数多菌丝变异的可能性大；③如改用橡皮塞并用石蜡扣，可保藏1年～3年。
（2）液体石蜡保藏。液体石蜡保藏也称为矿油保藏，即用矿油覆盖试管斜面试管保藏的方法。矿油是指无色、透明、黏稠、性质稳定、不易被微生物分解的石蜡油和液体石蜡，将其覆盖在斜面菌种之上，可以隔绝空气，防治培养基水分蒸发，抑制微生物的代谢活动，推迟细胞老化，从而达到长期保藏菌种的目的。特点：
①方法简便易行，保藏条件不严格，保藏时间长，可作为长期保藏菌种的方法；②菌种必须垂直放，放置不方便。
（3）滤纸保藏。滤纸保藏是一种以无菌滤纸作为食用菌孢子吸附载体长期保藏菌种的方法，又称滤纸孢子保藏法。特点：技术要求高，设备费用大，菌种不易衰老退化，菌种保藏时间长很少变异。
（4）自然基质保藏。自然基质保藏就是以不含毒性、刺激性和抑菌性而富含营养的自然生长的基质作培养基来保藏菌种的方法。自然基质很多，食用菌常用的自然基质有发酵的粪草、木屑及枝条基质等，取材方便，制作方法简便，保藏时间也较长。使用时，只需取一块、一粒或一条培养物放在新鲜的培养基上，并在适温下培养即可。特点：方法简便易行，保藏时间长。

‘捌’ 菌种衰退的原因是什么怎样防止衰退

菌种退化是客观规律，退化的菌种很难恢复原状。
（1）退化原因
退化菌种的菌丝在培养基上表现生长很慢，长势弱，稀疏，伸入培养基深层无力，分泌色素差；出耳慢，中途停止发育，子实体形态不一致，大小、厚薄不均，颜色改变，产量低。菌种退化原因主要有以下几方面：
①基因变异。遗传特性的表现是基因与环境因子共同作用的结果。当基因往性状差的方向发生变异时，即使环境条件适宜，也必然造成种性退化。
②无限继代。制种技术和条件上的差别，只作组织分离、不作出耳鉴定，无限继代、无限制地转管，这些做法都加速了菌种的退化。
③营养不良。长期使用单一种类和配方、成分基本相同的培养基，造成营养不能达到生理要求，菌丝生长活力由强变弱，衰老退化。
④环境欠佳。菌丝生长发育期环境不良，杂菌污染，也会加速菌种退化。
（2）防止措施
根据菌种衰老退化的原因，要针对性地采取以下措施：
①减少扩接。菌种的退化、种性变异，是在繁殖过程中发生的，可采用控制菌种移接次数来防止。当获得优良菌种后，严格控制转管次数。生产中应减少菌种扩接次数。
②防止突变。采用0～4℃低温保藏菌种，有条件时在液氮超低温条件下保藏。
③分离复壮。优质菌种，需要经常复壮。每次生产出耳后，应挑选优良子实体，进行组织分离。每年进行一次孢子分离，经出耳鉴定后，选择性状优良的再进行组织分离。总之，有性孢子分离与无性组织分离要交替使用。用有性繁殖来发现好的变异菌株，用组织分离来巩固这些优良菌株的遗传特性。复壮的措施很多，诸如更换培养基、创造适宜环境、防止杂菌污染及避免多品种混合栽培等。