用于微生物学的明胶Pka是多少

1. 食品微生物学的课后答案

微生物(microorganism简称microbe)是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。

原核：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体。
真核：真菌、藻类、原生动物
非细胞类：病毒和亚病毒

一般地，在中国大陆地区的教科书中，均将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体。
微生物的定义
一切肉眼看不见的或看不清的微小生物的总称
1 特点: 个体微小,一般<0.1mm
构造简单,有单细胞的,简单多细胞的,非细胞的
进化地位低
2 分类 原核类: 三菌,三体
真核类: 真菌,原生动物,显微藻类
非细胞类: 病毒,亚病毒 ( 类病毒,拟病毒,朊病毒)
3 五大共性: 体积小,面积大
吸收多,转化快
生长旺,繁殖快
适应强,易变异
分布广,种类多
二、微生物的类群
1 细菌:
(1)定义:一类细胞细短,结构简单,胞壁坚韧,多以二分裂方式繁殖和水生性强的原核生物
(2)分布:温暖,潮湿和富含有机质的地方
(3)结构:主要是单细胞的原核生物,有球形,杆形,螺旋形

细胞壁
基本结构 细胞膜
细胞质
结构 拟核

鞭毛
特殊结构 荚膜
芽孢
(4)繁殖: 主要以二分裂方式进行繁殖的
(5)菌落: 单个细菌用肉眼是看不见的,当单个或少数细菌在固体培养基啊行大量繁殖时,便会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞群落.
菌落是菌种鉴定的重要依据.不同种类的细菌菌落的大小,形状光泽度颜色硬度透明毒都不同.
2 放线菌
(1)定义:一类主要成菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物
(2)分布:含水量较低,有机物较丰富的,呈微碱性的土壤中
(3)形态构造:主要由菌丝组成,包括基内菌丝和气生菌丝(部分气生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子)
(4)繁殖:通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖
无性繁殖 有性繁殖
(5)菌落:在固体培养基上:干燥,不透明,表面呈致密的丝绒状,彩色干粉
3 病毒
(1) 定义:一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的”非细胞生物”,但是它的生存必须依赖于活细胞.
(2)结构:
(3)大小:
一般直径在100nm左右
最大的病毒直径为200nm的牛痘病毒
最小的病毒直径为28nm的脊髓灰质炎病毒
(4)增殖:以 噬菌体为例:
吸附 侵入 增殖 装配 释放
第二节微生物的营养
一、微生物的化学组成
C,H,O,N,P,S以及其他元素
二、微生物的营养物质
1 水和无机盐
2 碳源:凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质
来源
作用
3氮源:凡能为微生物提供所必需氮元素的营养物质
来源
作用:主要用于合成蛋白质,核酸以及含氮的代谢产物
4 能源:能为微生物生命活动提供最初能源来源的营养物质或辐射能
根据碳源和能源分类:
5生长因子:微生物生长不可缺少的微量有机物

能引起人和动物致病的微生物叫病源微生物有八大类：
1.真菌:引起皮肤病。深部组织上感染。
2放线菌：皮肤，伤口感染。
3螺旋体：皮肤病，血液感染 如梅毒，钩端螺旋体病。
4细菌：皮肤病化脓，上呼吸道感染 ，泌尿道感染，食物中毒，败血压症，急性传染病等。
5立克次氏体：斑疹伤寒等。
6衣原体：沙眼，泌尿生殖道感染。
7病毒：肝炎，乙型脑炎，麻疹，艾滋病等。
8支原体：肺炎，尿路感染。
生物界的微生物达几万种，大多数对人类有益，只有一少部份能致病。有些微生物通常不致病，在特定环境下能引起感染称条件致病菌。 能引起食品变质，腐败，正因为它们分解自然界的物体，才能完成大自然的物质循环。
有些人误将真菌当作细菌，是一种比较普遍的误解。尤其以80年代以前未受过系统生物学教育者。

2. 明胶冻力分几级，180.160.150.120ps怎么分 它的冻力受什么因素影响

以新鲜牛皮和猪皮为原料，采用全套不锈钢设备，严格筛选鲜骨皮，通过反复洗浸、脱脂中和、蒸煮液化、灭菌过滤、浓缩烘干等几十道工序流水线制成。生产出的明胶为一种无味、无色（略带浅黄色）、半透明、坚硬的非晶态物，其不溶于有机溶剂，它吸水性强、粘度高，明胶是肽分子聚合物质，是胶原蛋白质的水解产物，所以可作为一种添加剂，我们生产的食用明胶因其具有许多独特的理化性能和较高的营养价值，富含人体必须的18种氨基酸,它可以直接制成浓汤、肉皮冻子、肉食罐头,水晶冻、色拉、蛋黄汁、糖霜、奶油糖、香味酱、巧克力、饮料、啤酒等供人们食用。我厂生产的工业明胶为无色至淡黄色透明或半透明等薄片或粉粒。无味，无臭。在冷水中吸水膨胀。广泛用于纺织、印刷、印染、塑料、电子、国防、航空,砂布砂纸、火柴、墨、橡胶填料、工艺品粘贴、木器家具、皮革上光、染织上浆、冶金镀液、纸钞涂质、化妆发胶、等工业和部门中。 其中有用于提取水解动物蛋白质的低粘度低灰份的工业明胶还有专用于饲料添加剂的工业明胶。它的分子量为1-7万,高级明胶分子量在10-15万以内。明胶是一种含硫氨酸很低而内氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等含量很高.明胶不易溶于冷水,但能吸收冷水的重量却是自身的5-10倍,易溶于温水,冷却形成凝胶,胶熔点在24-28°C之间,其溶解度与凝固温度相差很小,易受水份、温度、湿度的影响而变质。
从动物的胶原质中，通过部分酸法水解(A型)，或者部分碱法水解(B型)，甚至还可以通过酶解，提纯而获得的胶原蛋白。
明胶(Gelatin)是胶原的水解产物，是一种无脂肪的高蛋白，且不含胆固醇，是一种天然营养型的食品增稠剂。食用后既不会使人发胖，也不会导致体力下降。明胶还是一种强有力的保护胶体，乳化力强，进入胃后能抑制牛奶、豆浆等蛋白质因胃酸作用而引起的凝聚作用，从而有利于食物消化。
【分类】
明胶按用途可分为照相、食用、药用及工业四类。
【性状】
本品为淡黄色至黄色、半透明、微带光泽的粉粒或薄片；无臭；潮湿后，易为细菌分解；在水中久浸即吸水膨胀并软化，重量可增加5 ～10倍。 本品在热水、醋酸或甘油与水的热混合液中溶解，在乙醇、氯仿或乙醚中不溶。
【类别】
赋形剂。
【贮藏】
密闭，在干燥处保存。
【制剂】
吸收性明胶海绵
【来源】
淡黄至白色，透明带光泽的粉粒，无臭无肉眼可见的杂质。明胶以动物皮加工而成，骨胶以动物骨头加工制成：应用于医药、胶囊、片剂；食品：糕点、糖果、冰糕、香肠、粉丝、饲料加工；工业：胶合板、纱布、砂石、印刷、粘合剂等。
[编辑本段]明胶成分与特性
成分：
（1）食用明胶是由猪、牛、骡、马的皮子之角料，（其它动物皮除外）经除杂、消毒、蒸煮形成汁子，再经脱水、制造形成的胶条、胶片、粉粒状物（一般常用粉粒状胶）。
（2）药用明胶是选用动物皮、骨和筋腱，经复杂的理化处理制得的无脂肪高蛋白易被人体吸收的高级胶品。具有粘度高、冻力高、易凝冻等物理特点。
特性：
⑴、药用明胶是选用动物皮、骨和筋腱，经复杂的理化处理制得的无脂肪高蛋白易被人体吸收的高级胶品。具有粘度高、冻力高、易凝冻等物理特点。外观为淡黄色至黄色细粒,应保持干燥、洁净、均匀,无夹杂物。应通过孔径4mm标准筛网。
⑵、食用明胶为淡黄色至黄色细粒,应保持干燥、洁净、均匀,无夹杂物。本品是由猪、牛、骡、马的皮子之角料，（其它动物皮除外）经除杂、消毒、蒸煮形成汁子，再经脱水、制造形成的胶条、胶片、粉粒状物（一般常用粉粒状胶）。应通过孔径4mm标准筛网即5目。本品含有18种氨基酸和90%的胶原蛋白,富保健美容效果,具有优良的胶体保护性、表面活性、粘稠性、成膜性、悬乳性、缓冲性、浸润性、稳定性和水易溶性。
明胶的组成和性质
组成明胶的蛋白质中含有18种氨基酸，其中7种为人体所必需。除16％以下的水分和无机盐外，明胶中蛋白质的含量占82％以上，是一种理想的蛋白源。明胶的成品为无色或淡黄色的透明薄片或微粒。明胶不溶于冷水，但可缓慢吸水膨胀软化，明胶可吸收相当于其重量5—10倍的水。依据来源不同，明胶的物理性质也有较大的差异，其中以猪皮明胶性质较优，透明度高，可塑性强。
明胶可溶于热水，形成热可逆性凝胶，它具有极其优良的物理性质，如胶冻力、亲和性、高度分散性、低粘度特性、分散稳定性、持水性。被覆性、韧性及可逆性等，因此明胶是一种重要的食品添加剂，如作为食品的胶冻剂、稳定剂。增稠剂、发泡剂。乳化剂、分散剂、澄清剂等，被广泛应用。
[编辑本段]明胶应用
食用明胶可用于医用软硬胶囊、外科敷料、止血海棉、肉冻、食品添加剂、罐头、糖果、冰糕、火腿肠、皮冻、汽水悬浮剂、检剂、淀剂、雪糕等食品行业等、执行国家标准GB6783-94。
药用明胶主要用于软硬胶囊、片剂糖衣的原材料。
工业明胶主要用于胶合板、纱布、砂石、印刷、粘合剂等。
[编辑本段]明胶测定与鉴别
【鉴别】
(1) 、取本品约0.5g，加水50ml，加热使溶解后，取溶液5ml ，加重铬酸钾试液4 份与稀盐酸1 份的混合液数滴，即生成桔黄色絮状沉淀。
(2) 、取鉴别(1) 项下剩余的溶液1ml ，加水100ml ，摇匀后，加鞣酸试液数滴，即发生浑浊。
(3)、 取本品，加钠石灰后，加热，即发生氨臭。
【检查】
酸度取本品1.0g，加入100ml 热水中，充分振摇使溶解，放冷至35℃，
依法测定（附录Ⅳ H），pH值应为3.6～7.6 。
【透明度】
取本品5.0g，加水90ml使膨胀后，在65～70℃水浴中加热溶解，取出，加水使成100ml ；分取5ml ，置25ml纳氏比色管中，立即与同体积的对照液（精密量取标准氯化钠溶液30ml，置50ml量瓶中，加硝酸与硝酸银试液各1ml ，用水稀释至刻度，在暗处放置5 分钟，必要时可用焦糖溶液调色）比较，不得更浑浊。
【亚硫酸盐 】
取本品20g ，置长颈圆底烧瓶中，加水50ml，放置使膨胀后，加稀硫酸50ml，即时连接冷凝管，用水蒸气蒸馏，馏液导入过氧化氢试液（对甲基红－亚甲蓝混合指示液显中性）20ml中，至馏出液达80ml，停止蒸馏；馏出液中加甲基红－亚甲蓝混合指示液数滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显草绿色，并将滴定的结果用空白试验校正，消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)不得过1.0ml 。
【干燥失重】
取本品约1g，置经105 ℃干燥至恒重的不锈钢或铝制器皿（直径约75mm）中，精密称定，加水10ml，放置，使膨胀后，置水浴上加热溶解，蒸干，在105 ℃干燥至恒重，减失重量不得过16.0％（附录Ⅷ L）。
【灰分】
取本品1.0g，置炽灼至恒重的坩锅中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化时，逐渐升高温度至600 ～700 ℃，使完全灰化并恒重，遗留灰分不得过2.0 ％。
【重金属 】
取灰分项下遗留的残渣，加盐酸2ml 与硝酸0.5ml ，置水浴上蒸干，加水5ml,再蒸干，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)5ml与水20ml，温热数分钟，加水适量使成50ml。分取20ml，加水5ml ，依法检查（附录Ⅷ H第一法），含重金属不得过百万分之五十。
【砷盐 】
取本品1.0g，加淀粉0.5g与氢氧化钙1.0g，加水少量，搅拌均匀，干燥后，先用小火炽灼使炭化，再在500 ～600 ℃炽灼成灰白色，放冷，加盐酸8ml 与水20ml溶解后，依法检查（附录Ⅷ J第一法），应符合规定（0.0002％）。
【凝冻浓度】
取本品1.10g ，置称定重量的锥形瓶中，加水80ml，在15～18℃放置 2小时，使完全膨胀后，置60℃水浴中加热溶解，取出，称重，加水适量使内容物成100g，取10ml，置内径13mm的试管中，在0℃冰浴中冷冻6 小时，取出，倒置10秒钟，应不流下。
[编辑本段]明胶在糖果中的应用
据报道，全世界的明胶有60％以上用于食品糖果工业。在糖果生产中，明胶用于生产奶糖。蛋白糖、棉花糖，果汁软糖、晶花软糖，橡皮糖等软糖。明胶具有吸水和支撑骨架的作用，明胶微粒溶于水后，能相互吸引、交织，形成叠叠层层的网状结构，并随温度下降而凝聚，使糖和水完全充塞在凝胶空隙内，使柔软的糖果能保持稳定形态，即使承受较大的荷载也不变形。明胶能控制糖结晶体变小，并防止糖浆中油水相对分离，作为乳化剂，黏合剂用于糖果制造中，可减少脆性，有利于成型，便于切割，从而防止了各类型糖果的破碎，提高成品率。
明胶在糖果中的一般加量为5％～10％。在晶花软糖中明胶用量6％时效果最好，在橡皮糖中明胶的添加量为6．17％，在牛轧糖中为0．16%～3％或更多些，在糖果粘液的浓糖浆中加量为1．15%～9％，糖味锭剂或枣子糖果的配料要求含明胶2％～7％。
在糖果生产中，使用明胶较淀粉、琼脂更富有弹性．韧性和透明性，特别是生产弹性充足、形态饱满的软糖、奶糖时，需要凝胶强度大的优质明胶。
食用明胶
一、 技术标准
食用明胶干燥、洁净、均匀 , 无夹杂物，通过孔径 4mm 标准筛网即 5 目。加工成 10-120 目状如奶粉。含有 18 种氨基酸和 90% 的胶原蛋白 , 富保健美容效果 , 具有优良的胶体保护性、表面活性、粘稠性、成膜性、悬乳性、缓冲性、浸润性、稳定性和水易溶性 , 用于肉冻、罐头、糖果、香肠、粉丝、方便面、雪糕等食品行业 , 执行国家标准 GB6783-94, 可指定办理 SGS 、 TTS 品质证和 CIQ 兽医卫生证及放行的换证凭条。
二、技术标准
食用明胶的理化微生物质量符合GB/T6783-1994技术标准
水分 % ≤14.0；胶冻强度(按水分12%商品胶6.67%)Bloom g ≥220；勃氏粘度(按水分12%商品6.67%)m≥3.0；透明度 mm ≥300；水不溶物 % ≤0`2；二氧化硫 mg/kg ≤40；PH值=4.5-6.5；重金属(以Pb计) mg/kg ≤50；细菌总数 个/g ≤1000
三、用途
明胶按用途可分为照相、食用、药用及工业四类。食用明胶作为一种增稠剂广泛使用于食品工业的添加如果冻、食用色素、高级软糖、冰淇淋、干酷、酸奶、冷冻食品等。在化工行业主要用作粘合、乳化和高级化妆品等制作的原料。
四、使用说明
使用前须用冷水浸泡数小时（可避免加热时产生大量气泡和末完全膨胀所产生的僵块），待完全膨胀后再隔水加热，胶液温度控制在70°C以下。使其完全溶解后方可使用。尚末用完的胶液应贮于冷库或通风阴凉处，以免胶阮水解变质，影响使用效果。
五、包装、贮存
本品采用纸塑复合袋包装，通常包装规格为每袋25kg。本品应密封贮藏于干燥、通风、阴凉处、不得露天堆放，防止受潮、受热和曝晒。常温下保质期为二年。
[编辑本段]照相明胶
明胶在胶卷生产的每一步骤都起着非常关键的作用，它既能维持感光银盐的稳定分散, 以能让乳剂成熟更易于控制，同时还影响胶卷曝光和冲晒的效果。是国内照相企业主要的供应商，特别是彩胶已大量地被应用于彩色照片的制造冲印。
照相明胶是明胶中的高档产品，是感光材料生产中三大重要材料之一，由于它的物理化学性能独特，至今在银盐感光材料中做为载体，还没有可以全面取代明胶的物质。照相明胶可以广泛地应用于生产各种胶片、胶卷、医用X光胶片、印刷片、相纸等感光工业中。照相明胶分为彩色感光照相明胶和黑白照相明胶。
彩色感光照相明胶：彩色感光材料是当今高科技精细化工的精华，目前世界上仅有极少数国家能够生产。彩色感光材料生产所使用的照相明胶（简称“彩胶”），又是照相明胶中的高档次产品，它不仅具有更高的物理性能，对重金属等微量元素含量有更严格的控制要求，还具备更优良的感光性能。
黑白照相明胶：除用于黑白正负片、相纸、医用和工业用X光胶片外，还广泛用于报纸和书刊的印刷胶片。
[编辑本段]药用明胶
明胶的凝胶性、固水性、粘结性和溶解性等多种特性，令明胶在医药行业有关广泛的用途，其中最主要的有硬胶囊、软胶囊、代血浆和包衣等。
硬胶囊生产工艺
壁 厚
长 度
主要缺陷A
主要缺陷B
次要缺陷C 2.5
印字主要缺陷 0.15.m
印字次要缺陷 1.5
壁厚、长度、日视缺陷的判断标准及AQL值参照GBl3731和GB2828的规定
规格尺寸：长度、壁厚尺寸参考金域胶囊公司企标准或有供需双方商定。
A类缺陷：影响充填机正常运长转药物充填不足的缺陷。
B类缺陷：可能会影响胶囊充填机正常运转药物充填不足的缺陷。
C类缺陷：仅影响胶囊外观的缺陷。
印字主要缺陷：道致印字圃案不能碓定或不能辨认的印字缺陷。
细菌总数 个/g 1000 1000 1000
大肠杆菌 不得验出 不得验出 不得验出
霉菌 个/g 100 100 100
药用明胶质量标准
理化项目 类型250LB 类型240LB 类型220LB 类型200LB 类型250PS 类型240PS
胶冻强度（6.67%，10oC）, Bloom g ≥250 g ≥240 g ≥220 g ≥200 g 250±10 g 240±10 g
勃氏粘度（6.67%，60oC）,mPa·s 4.7~5.1 mPa.s 4.7~5.1 mPa.s 4.4~5.2 mPa.s 4.4~5.2 mPa.s ≥3.5 mPa.s ≥3.5 mPa.s
粘度下降（6.67%，37oC）,% ≤5% ≤5% ≤5% ≤6% ≤10% ≤10%
pH（1.0%，35oC） 5.5~5.9 5.5~5.9 5.5~5.9 5.5~5.9 4.5~6.5 4.5~6.5
灰分，% ≤1% ≤1% ≤1% ≤1% ≤1.5% ≤1.5%
水分，% ≤13% ≤13% ≤13% ≤13% ≤14% ≤14%
透过率450mm ≥88% ≥86% ≥80% ≥78% ≥70% ≥70%
透过率620mm ≥96% ≥95% ≥93% ≥92% ≥86% ≥86%
水不溶物，% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1% ≤0.1%
二氧化硫，mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg ≤40mg/kg
砷，mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg ≤0.8mg/kg
重金属（Pb计），mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤30mg/kg ≤50mg/kg ≤50mg/kg
颗粒尺寸（ASTM网筛） 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm) 8目(2.36mm)
细菌总数，个/g ≤100个/g ≤100个/g ≤100个/g ≤100个/g ≤500个/g ≤500个/g
大肠菌群，个/100g 10g中不得检出 10g中不得检出 10g中不得检出 10g中不得检出 10g中不得检出 10g中不得检出
沙门氏菌，10g中 25g中不得检出 25g中不得检出 25g中不得检出 25g中不得检出
[编辑本段]明胶软糖的制作要点
明胶的纤维状蛋白，极易受酸、碱的破坏，直至失去纤维的特征，改变明胶的性能。明胶受酸碱作用发生的变化以水为介质，这一过程可使明胶变成蛋白胨和氨基酸，因此，要注意软糖物料中酸的存在对明胶凝胶力的影响。
选择明胶时，要注意凝胶强度，优质明胶1％以下浓度也会凝胶，浓度为4％～5％时，凝胶强度每平方厘米承受约500g负重，明胶生产以黏度来控制明胶的质量，吸水率高，黏度也就大，所以选用的明胶强度要达到生产适用标准。
明胶软糖配方中要注意的问题是明胶的用量和抗结晶物质的选择。
【 配方】
砂糖40kg柠檬酸0.5kg淀粉糖浆32.5kg柠檬酸钠0.1kg转化糖浆15kg各种水果香精适量干明胶4.8kg各种着色剂适量配方2砂糖20kg柠檬酸0.35kg淀粉糖浆35kg柠檬酸钠——转化糖浆——各种水果香精适量干明胶4kg各种着色剂适量明胶的用量直接影响软糖的组织，量少组织柔软，量多弹性增加，韧性也增强，但韧性太大，食觉也会感到不舒服，所以明胶的用量一定要适当控制。一般柔软性软糖的明胶用量为5％左右，较有弹性的软糖用量为8％左右，如果软糖富有较大韧性，明胶用量就要在10％以上。
软糖所用的抗结晶物质，基本上都采用淀粉糖浆，而明胶软糖常常采用转化糖浆。这是因为明胶溶胶黏度很大，淀粉糖浆黏度也较大，当稍加冷却后，糖浆黏度往往影响浇模成型，所以用转化糖浆来代替部分淀粉糖浆，就能降低软糖糖浆的黏度。
明胶为一种蛋白质胶体，所以一般酸、碱、温度对蛋白质的影响作用，对明胶都会产生一定影响。在软糖的制作中，一般都以水果味为主，物料的溶化、脱水过程都在加温条件下完成，对明胶强度、黏度不可避免的造成影响。因此，在明胶软糖的实际制作过程中，控制好物料的pH，加热温度与时间，选择合适的明胶投入量。投入时间，选择合适的酸味剂及投入时间、投入量，要根据产品的不同设计要求，反复试验，才能制造出符合设计要求的合格产品。

3. 微生物学中的TVB-N是什么东西

关于挥发性盐基总氮的概念挥发性盐基总氮是指肉食品的水浸液中在碱性条件下能与水蒸气一起蒸馏出来的总氮量(t.tazv.zatilebasienitr.gen即TvB-N).目前挥发性盐基氮（TVB-N)值是国标中用于评价肉质鲜度的唯一理化指标.

4. 用于基因分型的荧光探针PCR原理是什么

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。
为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。
一、PCR的基本原理和基本程序
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。
二、PCR的特点
（一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显着地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。
（二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。
（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。
（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。
（五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。
三、PCR方法
（一）试剂
（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生
物都有自己特异的引物。
（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。
（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。
（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。
（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。
（二）操作程序
过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：
（1）向一微量离心管中依次加入
DNA模板 102-105拷贝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR缓冲液 1/10体积
ddH2O 补到终体积（终体积50μl-100μl）
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。
（2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。
（3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。
（4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。
在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。
四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响
（一）模板核酸
PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。
（二）引物
PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。
PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。
（三）缓冲液
PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。
反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。
（四）Mg2+
Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显着降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。
（五）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。
（六）耐热DNA聚合酶
PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。
（七）温度循环参数
1．变性温度与时间
PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。
2．复性温度与时间
变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。
3．延伸温度与时间
引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。
4．循环数：
循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。
五、PCR标本的制备
在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃，10min，离心取上清作为PCR模板即可。
六、PCR实验中常见问题对策
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。
（二）假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。
七、PCR扩增产物的分析法
PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。
（一）凝胶电泳分析法
PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。
电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。
凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。
（二）点杂交
当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验，用非放射性物质（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高，使用方便、安全、检测速度快。
（三）微孔板夹心杂交法
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBv DNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。
（四）PCR-ELISA法
本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5'端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此，可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因，而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

5. 微生物学课件资料

一 、 微生物学
⒈定义: 研究微生物在一定条件下的形态结构，生理生化，遗传变异以及微生物的进化，分类，生态等生命活动规律及其应用的一门科学。
2.研究对象——微生物
1）微生物与我们
微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。
细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034 × 10 12 吨；
每张纸币带细菌：900万个
人体体表及体内存在大量的微生物：
皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；
口腔：细菌种类超过500种；
肠道：微生物总量达100万亿，
粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；
每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万
少数微生物也是人类的敌人！
鼠疫；天花；艾滋病；疯牛病；埃博拉病毒；
可以说，微生物与人类关系的重要性，你怎么强调都不过分，微生物是一把十分锋利的双
刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。
微生物的特点：
（1）体积小， 面积大：测量单位：微米或钠米
杆菌的平均长度：2 微米；1500个杆菌首尾相连= 一粒芝麻的长度；10-100亿个细菌加起来重量 = 1毫克； 面积/体积比：人 = 1，大肠杆菌 = 30万；
这样大的比表面积特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换。微生物的其它很多属性都和这一特点密切相关。
对1cm3固体做10倍系列三维分割后的比面值变化
（2）吸收多 ，转化快：
微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广是动植物完全无法相比的！
纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、各种有机物均可被微生物作为粮食一头500 kg的食用公牛，24小时生产 0.5 kg蛋白质,
而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24小时可以生产 50000 kg优质蛋白质
（3）生长旺，繁殖快
大肠杆菌一个细胞重约10 –12 克，平均20分钟繁殖一代
24小时后： 4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨
48小时后：2.2 × 10 43个后代，重量达到2.2 × 10 25 吨
相当于4000个地球的重量！
（4）适应强，易变异：
抗热：有的细菌能在265个大气压，250 ℃的条件下生长；自然界中细菌生长的最高温度可以达到113 ℃ ；有些细菌的芽孢，需加热煮沸8小时才被杀死；
抗寒：有些微生物可以在―12℃ ~ ―30℃的低温生长；
抗酸碱：细菌能耐受并生长的pH范围：pH 0.5 ~ 13
耐渗透压：蜜饯、腌制品，饱和盐水（NaCl, 32%)中都有微生物生长；
抗压力：有些细菌可在1400个大气压下生长
个体小、结构简、且多与外界环境直接接触繁殖快、 数量多（突变率：10-5 – 10-10）短时间内产生大量的变异后代。
（5）分布广，种类多：
（6）起源早，发现晚：38亿年前，生命在海洋中出现300多年前人们才真正发现微生物的存在26亿年前，陆地上就可能存在微生物，虽然目前已定种的微生物只有大约10万种，远较动植物为少，但一般认为目前为人类所发现的微生物还不到自然界中微生物总数的1%
级界宽
（7）休眠长：世界上最古老的活细菌（芽孢）：2.5亿年
3.在生物界中的地位
微生物在生物五（六）界系统中的地位

Wittaker(1969): 五界系统
Woes(1977，1990): 三原界分类系统，包括细菌，古生菌，真核生物
4.内容及分科
二、微生物的发现和微生物学的建立和发展
（一）微生物的发现：我国8000年前就开始出现了曲蘖酿酒，；制酱，醋
4000年前埃及人已学会烘制面包和酿制果酒；
2500年前发明酿酱、醋，用曲治消化道疾病；
公元六世纪(北魏时期)贾思勰的巨着“齐民要术”；
公元2世纪，张仲景：禁食病死兽类的肉和不清洁食物；
公元前112年-212年间，华佗：“割腐肉以防传染”；
公元九世纪痘浆法、痘衣法预防天花；
1346年，克里米亚半岛上的法卡城之战(靼坦人-罗马人)；
16世纪，古罗巴医生G.Fracastoro：疾病是由肉眼看不见的生物(living creatures)引起的；
1641年，明末医生吴又可也提出“戾气”学说
显微镜的发明：列文虎克（荷兰）：1664年，英国人虎克（Robert Hooke）曾用原始的显微镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察，
首次看见并描述微生物：1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antony van leeuwenhoek）首次观察到了细菌。他没有上过大学，是一个只会荷兰语的小商人，但却在1680年被选为英国皇家学会的会员。列文虎克利用业余时间制造过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50~200倍。
（二）微生物学的建立和发展

2、微生物学的奠基
法国人巴斯德（Louis Pasteur）（1822～1895）
(1) 发现并证实发酵是由微生物引起的；
(2) 彻底否定了“自然发生”学说；
着名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物，是它们引起有机质的腐败。
(3) 免疫学——预防接种
首次制成狂犬疫苗
(4)其他贡献
巴斯德消毒法：60～65℃作短时间加热处理，杀死有害微生物

德国人柯赫（Robert Koch）（1843～1910）
（1）微生物学基本操作技术方面的贡献
a）细菌纯培养方法的建立
薯仔切面 → 营养明胶 → 营养琼脂（平皿）
b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养
c）流动蒸汽灭菌
（2）对病原细菌的研究作出了突出的贡献：
a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌
b）发现了肺结核病的病原菌；（1905年获诺贝尔奖）
c）证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则
——着名的柯赫原则

3、微生物学发展过程中的重大事件
1890 Von Behring��制备抗毒素治疗白喉和破伤风
1892 Ivanovsky 提供烟草花叶病毒是由病毒引起的证据；
1928 Griffith发现细菌转化；
对其机理的研究导致DNA是遗传物质的确证；外源遗传物质导入各种细胞的基因重组技术的建立；
1929 Fleming 发现青霉素；
1944 Avery等证实转化过程中DNA是遗传信息的载体；
1953 Watson和Crick��提出DNA双螺旋结构；
1970～1972 Arber、Smith和Nathans发现并提纯了DNA限制性内切酶
1977 Woese提出古生菌是不同于细菌和真核生物的特殊类群 Sanger首次对f×174噬菌体DNA进行了全序列分析；
1982～1983 �Prusiner�发现朊病毒(prion)；
1983～1984 �Mullis 建立PCR技术；
1995 第一个独立生活的细菌(流感嗜血杆菌)全基团组序列测定完成；
1996 第一个自养生活的古生菌基因组测定完成
1997 第一个真核生物(啤酒酵母)基因组测序完成
4、20世纪的微生物学
十九世纪末到二十世纪中期：
微生物学：鉴定病原菌、研究免疫学及其在预防疾病中的作用、寻找化学治疗药物、分析微生物的化学活性。
普通生物学：细胞的构造及其在繁殖和发展中的作用、植物和动物的遗传和进化的机制。
20世纪40年代后，微生物自身的特点使其成为生物学研究的“明星”，微生物学很快与生物学主流汇合，并被推到了整个生命科学发展的前沿，获得了迅速的发展，在生命科学的发展中作出了巨大的贡献。
微生物学与生物学发展的主流汇合、交叉，获得了全面、深入的发展
5、21世纪微生物学展望
与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展学科交叉永远是科学创新的源泉！
微生物基因组的序列测定和分析；
微生物的快速检定；
微量热技术对生命过程的研究
计算机技术与微生物学的结合。
三、 微生物学对生命科学的促进
1. 多学科交叉促进微生物学的全面发展
2. 促进重大理论问题的突破
3. 对生命科学研究技术的贡献
4. 微生物与人类基因组计划

四、我国微生物学界面临的机遇和挑战

思 考 题：
• 试根据微生物的特点，谈谈为什么说微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友。
• 为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的真正奠基人？

6. 明胶,果胶,琼脂有什么区别

一、成分不同

1、明胶：主要成分为蛋白质。

2、果胶：其组成有同质多糖和杂多糖两种类型。

3、琼脂：主要成分是膳食纤维、蛋白质。

二、性质不同

1、明胶：可溶于热水，不溶于冷水。

2、果胶：在酸性溶液中较在碱性溶液中稳定，通常按其酯化度分为高酯果胶及低酯果胶。

3、琼脂：具有凝固性、稳定性，能与一些物质形成络合物等物理化学性质。

三、用途不同

1、明胶：全世界的明胶有60%以上用于食品糖果工业。

2、果胶：果胶作为一种高档的天然食品添加剂和保健品，可广泛应用于食品、医药保健品和一些化妆品中。商业化生产果胶的原料主要是柑橘皮及苹果皮。国内果胶资源丰富，但加工利用率低，大部分原料都被直接丢弃，如能加以综合利用，将会带来巨大的经济效应。

3、琼脂：广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。琼脂在化学工业，医学科研，可作培养基，药膏基及其他用途。

7. 柯赫对微生物学的贡献 柯赫原则有哪些

贡献：⑴对微生物学基本操作技术方面的贡献 a）细菌纯培养方法的建立 薯仔切面 → 营养明胶 → 营养琼脂（平皿） b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养 c）流动蒸汽灭菌 d）染色观察和显微摄影 ⑵对病原细菌研究的贡献： a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌 b）发现了肺结核病的病原菌（1905 年获诺贝尔奖）
柯赫原则： ① 在每一相同病例中都出现这种微生物 ②要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来 ③用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生 ④从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来

8. 琼脂、鱼胶粉和明胶有什么区别

主要区别有，性质不同、特点不同、应用不同，具体如下：

一、性质不同

1、琼脂

琼脂，又名洋菜、海东菜、冻粉、琼胶、石花胶、燕菜精等，是以藻类的石花菜属及江蓠属制成的产品，为最常用的微生物培养基的固化剂。

二、特点不同

1、琼脂

琼脂的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95℃时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。

2、鱼胶粉

鱼胶粉有抗氧化的作用，能促进细胞的新陈代谢，是纯蛋白质成份，不含淀粉，不含脂肪，不但是低热量的健康低卡食品，更可以补充肌肤大量的胶原蛋白。

3、明胶

食用明胶是胶原的水解产物，是一种无脂肪的高蛋白，且不含胆固醇，是一种天然营养型的食品增稠剂。食用后既不会使人发胖，也不会导致体力下降。明胶亦是一种强有力的保护胶体，乳化力强，进入胃后能抑制牛奶、豆浆等蛋白质因胃酸作用而引起的凝聚作用，从而有利于食物消化 。

三、应用不同

1、琼脂

广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。

2、鱼胶粉

鱼胶粉的用途非常广泛，不但可以自制果冻，更是制作慕斯蛋糕等各种甜点不可或缺的原料。

3、明胶

食用明胶作为一种增稠剂广泛使用于食品工业的添加如果冻、食用色素、高级软糖、冰激凌、干醋、酸奶、冷冻食品等。

9. 聚合酶链反应的反应体系

PCR基本原理示意图（如右图）：
在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。 用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2 优于Mn2 ，而Ca2 无任何作用。
1．Mg2 浓度Mg2 的最佳浓度为1.5mmol/L（当各种dNTP浓度为200mmol/L时），但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg2 过量易生成非特异性扩增产物，Mg2 不足易使产量降低。
样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2 结合而降低Mg2 有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。
dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg2 的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2 浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2 的浓度。
2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。
3．KCl浓度K 浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。
4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。
5．二甲基亚砜（DMSO）在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。
决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度计定量。 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。
由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定义是：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。
分析条件为25nmol/L TAPS（三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巯基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP为100mmol/L(由不标记及α-32P标记混合)，12.μg变性鲱鱼精子DNA，最终体积50μl。 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。
DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA（如基因组的DNA时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。
模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择，一般用1.5%～2%，电泳电压75V，待样品进行凝胶内距胶末端1cm时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。
由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng，其荧光强度与DNA含量成正比。
DNA分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照DNA分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析扩增的DNA片段。 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数
在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度比扩增引物的融解温度TTm低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。
3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。
4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。
扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。
二、引物引物设计
要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。
引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：
1．引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。
2．（G C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳。
3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。例如：
4．引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。
另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。
5．引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。
引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。
人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20℃冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存1～2年。
三、DNA聚合酶
在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力，它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于PCR。
1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95℃的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：①Klenow酶的最适温度为37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1μg基因组DNA开始）而Taq酶为30个。③延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。
Taq酶由水栖高温菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃。最初从中分离到分子量60～68KDa，比活性为2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃时Kact>60nt/s；55℃可达24nt/s；37℃时为1.5nt/s，而22℃时低至0.25nt/s。高于90℃时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。
在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的时间分别为130、40及5～6min，在50次循环的PCR中当管内最高温度为95℃。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95℃。
Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。
Taq酶具有依赖DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5’-32P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为200μmol/L，Mg2 为1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性对测序有利。
2．影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2 为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%～50%。dNTP能与Mg2 结合，故游离Mg2 只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至4～6mmol/L时，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μlPCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。
用鲱精DNA，70℃，10min内dNTP的掺入量计算，标准条件为100%。
纯9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP浓度。但Taq酶具有DNA依赖的链移位5’→3’核酸外切酶活力。对5’→3’32P标记寡核苷酸单链，或与MB模板杂交时均只有极少的降解力。
中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%～60%，最佳KCl浓度为50mmol/L，浓度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可产生中度抑制或无作用。
低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用。
3．第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5℃的半衰期从Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR（Multiplex PCR）更为有利。
VentTMDNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100℃高温且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在104℃生长的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半寿期达23h（Vent酶为6.7h,Taq酶为1h）。
4．RTth逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录-PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，二种活性分别依赖于Mn2 Mg2 ，这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA即可有效地进行RT-PCR，得到特异的DNA片段，从而非常有利于逆转录PCR的发展。
耐热DNA聚合酶的研究得到长足的发展，这在PCR发展中起到了重要的作用。相信随着进一步的研究，将使人们对耐热DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。
我国的PCR研究发展很快，其关键试剂-耐热DNA聚合酶-也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4DNA聚合酶，其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶，为中国PCR的开展提供了保证。
四、影响PCR特异性的因素
通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。
五、扩增平坡
扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：
1．底物过剩因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100μl反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1μg（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。
2．非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。
3．退火时产物的单链自己缔合两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100μl时即可发生此现象，除稀释外无法克服。
4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。
总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。

10. 医学微生物学题库什么是培养基分为几类主要用途

培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。 （高中只用掌握固体培养基和液体培养基就可以了。）
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。

培养基按其特殊用途可分为选择性培养基、鉴别培养基和加富培养基。（高中只用掌握选择性培养基和鉴别培养基就可以了。）
(1)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
(2)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。
(3)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。
其它种分法高中就不用掌握了。仅供参考。
如果你还想了解更多，可以网上搜索关键词“培养基的种类”。