1. 大肠杆菌没有细胞器,怎样合成干扰素和胰岛素
大肠杆菌有核糖体细胞器,把干扰素和胰岛素的基因通过基因工程导入大肠杆菌,能表达的话就能合成干扰素和胰岛素。大肠杆菌没有细胞器不对。
2. 基因工程的方法是怎么生产干扰素的
已知干扰素基因则可直接化学合成法合成,也可通过PCR方法得到干扰素基因序列,在目的基因两端加上粘性末端,连接到有相同粘性末端的原核生物表达质粒载体上(载体上含抗某一抗生素的基因),将质粒转导入感受态菌株,摇菌1小时后涂平板(平板中加入该抗生素,筛选成功导入质粒的菌株),挑单克隆摇菌过夜,然后鉴定导入的质粒是否成功表达干扰素。菌种可冻存于-80度。发酵罐大量培养后,取发酵液离心收集、纯化干扰素。
3. 为什么可以用大肠杆菌生产干扰素
根据生物学书中的定义,干扰素是哺乳动物细胞在诱导物的诱导下产生的一种特异糖蛋白,由此可知,由哺乳动物细胞分泌的天然干扰素是糖蛋白,但是这并不意味着由基因工程技术生产的重组人干扰素就一定是糖蛋白。
据科学家的研究资料显示,用大肠杆菌生产出来的干扰素是没有糖链的,但同样能够抑制病毒在细胞内的增殖,加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用。由此可知,该假设对于大肠杆菌表达系统并不成立,大肠杆菌可以生产干扰素,但没有证据表明大肠杆菌能生产糖蛋白。
既然基因工程方法生产出来的干扰素没有糖链也能发挥作用,那哺乳动物细胞为何要“多此一举”给干扰素加上糖链呢?糖链之于糖蛋白的意义是什么?一方面,真核细胞的糖基化体系给蛋白加上糖链后,能够帮助蛋白折叠成正确的构像,同时糖蛋白分子表面的极性糖链有助于蛋白质的溶解,防止蛋白聚集沉淀,从而能使糖蛋白分泌到细胞外。而在大肠杆菌表达系统中,由于缺乏糖基化体系,表达的非糖基化蛋白常常会在细菌体中聚集成不溶性的包涵体(inclusion body)。所谓包涵体,是指由于表达部位的低电势以及外源蛋白分子的特殊结构如Cys含量较高、低电荷、无糖基化等,使得外源蛋白与其周围的杂蛋白、核酸等形成的不溶性聚合体。包涵体中的蛋白是没有生物活性的,需要通过后续的溶解、纯化、复性等操作帮助变性的包涵体蛋白折叠成有生物活性的蛋白。科学家用基因工程的方法在大肠杆菌细胞内获得的干扰素就是以包涵体的形式存在的,因此,最初获得的干扰素是没有活性的,通过之后的纯化、复性等一系列的操作,科学家才得到了有生物活性的重组人干扰素。另一方面,糖链对蛋白的稳定性和半寿期(half life,一种物质其质量的一半被代谢或排出所需的时间)有一定的影响,一些糖蛋白在去除糖链后虽然仍具有一定的生物活性,但是易被蛋白酶降解。因此,真核细胞表达的干扰素需要糖链来稳定结构、帮助溶解,并通过转运系统分泌到细胞外,进入血液循环系统,以发挥其抗病毒抗肿瘤的生物功效。
大肠杆菌是不是就一定不能生产糖蛋白呢?在上个世纪,也许不可能,但是现在,随着科学技术的发展和科学研究的进一步深入,科学家们发现在一种名为Campylobacter jejuni的细菌里存在生产糖蛋白的基因簇,即pgl基因簇,此基因编码的蛋白能够起糖基转移酶的作用,科学家用基因工程方法将这套基因克隆至大肠杆菌共表达,使得大肠杆菌也能够生产相应的糖蛋白。虽然大肠杆菌生产糖蛋白与真核细胞生产糖蛋白在合成机理、糖链结构等方面有很多差异,而且用大肠杆菌生产糖蛋白还处于实验室探索研究的阶段,但相信随着这方面研究工作的不断开展,有希望在不久的将来研发出一套成本低、产量高、质量好的大肠杆菌重组糖蛋白表达系统。
4. 有人尝试将干扰素基因与大肠杆菌的质粒重组,转入大肠杆菌体内后,形成工程菌,此操作能制备到干扰素吗
可以。
基因工程的基本原理:将一种生物的基因——外源基因,结合到另一种生物的基因组DNA中并表达,产生人类所需要的产物。如,将人类的胰岛素基因,导入大肠杆菌细胞并表达,使大肠杆菌产生人类胰岛素。基因工程是经过预先设计的,其结果使生物获得新的遗传性状或创造出新的生物类型。
步骤:
(1) 提取目的基因
方法:
①从生物体细胞中分离。先定位,在用限制酶切取。
②化学方法人工合成
(2)目的基因与运载体重组
用相同限制酶切割含目的基因的DNA和质粒,再用DNA连接酶使两者形成形成重组质粒。
(3)重组质粒导入受体细胞
受体细胞大多数是微生物,也可以是植物细胞和动物细胞;
动物基因工程通常以动物的受精卵为受体细胞,用显微注射方法将目的基因
导入受精卵;
重组质粒必须导入活细胞,借助活细胞的代谢才能使目的基因表达。
筛选含目的基因的受体细胞
重组质粒导入受体细胞的概率极低,因此重组质粒是否导入,以及导入后目的基因是否表达,都必须经过检测加以筛选;
为了便于筛选,作为运载体的质粒必须带有标记基因,如抗生素抗性基因,这样,若导入目的基因的受体微生物能在含抗生素的培养基中生长,说明目的基因已成功导入,若检测到人类所需要的基因产物则说明目的基因已成功表达;
将筛选出的受体菌培养成工程菌,通过微生物的发酵大量生产人类需要的基因产品。
在工业上的应用:利用微生物繁殖快、结构简单、遗传操作较容易等优点,在制药业,通过工程菌生产胰岛素、干扰素等药物,不仅成本低,而且产量高。
5. 用基因工程生产干扰素的具体过程
1. 设计合成干扰素基因的两端引物(完全的),每条引物内或5'-端最好有内切酶酶切位点。
2. 有药物诱导细胞,如佛波酯,使细胞表达干扰素升高。
3. 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4. 用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
6. 提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切,用连接酶连接
7.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰素序列比对。
8.鉴定序列无误后(无义突变也行),导入受体细胞,筛选
9.筛选出来后,提取重组产生的干扰素,活性测定
10.有活性再扩大规模培养,提取生产
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6. 如何提取干扰素
顾名思义,干扰素是一种能起干扰作用的物质。
1957年,美国的两位科学家艾萨克斯和林登曼首先发现,当病毒感染人体后,受到病毒入侵的细胞里会产生和释放出一种蛋白质进行“自卫反击”,干扰和抑制病毒的“为非作歹”。这种蛋白质被称为干扰素。
这一发现,极大地震动了全世界的科学界。许多国家的科研机构不惜资金投入研究,先后证明,用干扰素治疗病毒引起的感冒、水痘、角膜炎、肝炎、麻疹等都有很好的疗效。尤其令人注目的是,干扰素对癌细胞也有抑制作用。有些科学工作者还探明,干扰素对人体的免疫能力也有刺激作用,能唤起整个机体的防御系统,提高它们的机能和作用,警觉地进入“战备状态”,从而大大地增强身体的抵抗力。有人预言,未来年代里药品的新秀可能将是干扰素的“天下”。
干扰素虽有如此神效,但是它的提取工作非常困难。因为干扰素只有在受到病毒入侵的细胞中才能产生,而且数量极少。1979年芬兰红十字会和赫尔辛基卫生实验所用了4.5万升(1升相当于1000cc)人血,才煞费苦心地提炼了0.4克干扰素。据法国医疗单位计算,治疗一个感冒病患者要花费1万法郎,而医治一位癌症病人,那就需要花费5万多法郎。可谓是世界上最昂贵的药品之一了。
那么,能不能从别的动物血液中提取呢?也不行。因为干扰素有很强的专一性,人体用的干扰素只能从人体细胞中取得;把从别的动物身上取得的干扰素用到人身上,数量再多也没有效果。人们正在积极寻找新的办法。前不久,美国和瑞士的科学工作者分别宣布,他们已经采用基因工程的办法,把人干扰素基因移植到大肠杆菌细胞里去,使大肠杆菌在新移植来的基因的指导下,合成我们所需要的物质——人干扰素。
我们知道,繁殖快本来就是微生物的特点,而大肠杆菌在这方面更是首屈一指。它一般20-30分钟就能繁殖一代,24小时可繁殖七十多代。而且大肠杆菌的食料简单,来源丰富,培养并不困难。因此,用它们来生产干扰素,不仅产量高,而且价格低廉,一旦付诸实施,微生物又将为人类的健康事业作出新的贡献。
7. 大肠杆菌中没有内质网和高尔基体,为什么用大肠杆菌以及酵母菌产生白细胞干扰素,如何实现糖基化
用转基因技术,将相关基因导入大肠杆菌并使它表达,这样的大肠杆菌就可以生产干扰素了。
至于如何实现糖基化,我推荐你读一篇文章,讲解非常详细,我给你贴上网址:
http://www.pep.com.cn/gzsw/jshzhx/tbziy/kbshy/jcjxi_1/bxyi/201008/t20100831_839762.htm
8. 基因工程中,用大肠杆菌作受体,生产干扰素,为什么不能以分泌物的形式获得
应该是这样的
大肠杆菌为原核生物,无高尔基体,所以干扰素不能以分泌物形式
而 酵母菌为真核生物,有高尔基体,所以干扰素能以分泌物形式
9. 是否可用基因工程,让大肠杆菌合成干扰素
可以 但是干扰素得基因必须人工合成 不能用天然的
干扰素是淋巴因子 属于真核生物体内的基因控制合成的 真核生物体内的基因是断裂基因
有内含子 大肠杆菌是原核生物 转录时不能把内含子的那部分序列去掉 人工合成的基因不具有内含子 所以用人工合成的基因可以让大肠杆菌合成干扰素
10. 怎样让大肠杆菌制造干扰素
通过基因工程给大肠杆菌增长产生干扰素的基因片断