1. 高通量测序中如何判断土壤微生物数量的多少
在陆地生态系统中，在土壤中生活有数量庞大的微生物种群，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物, 以及真核生物如真菌、藻类( 蓝藻除外) 、地衣等。它们与植物和动物有着明确的分工，主要扮演“分解者”的角色，几乎参与土壤中一切生物和生物化学反应，担负着地球C、N、P、S 等物质循环的“调节器”[1 ]、土壤养分植物有效性的“转化器”和污染环境的“净化器”等多方面生态功能[2 ]。土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因) 多样性、生态特征多样性和功能多样性[3 ]。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等现代生物学分子生物学技术的迅速发展, 人们对土壤微生物多样性有了更多的了解；高通量测序技术的发展则为研究土壤宏基因组提供了大量数据，为直接探究土壤中的微生物群落结构提供了客观而全面的信息。
一、对土壤微生物进行研究的方法
1、微生物平板培养法
传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。
这种方法只限于极少量（0.1%-1%）可以培养的微生物类群，无法对绝大多数微生物的分类地位和系统发育关系的深入研究。
2、分子生物学技术结合测序的方法
在过去的20多年里，分子生物学技术，尤其16SrDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌的研究中。20世纪80年代以来, 逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、稳定同位素探针( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。
其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200bp ～900bp为佳，超出此范围的片段难以检测[4]，PCR 扩增所需G/C 碱基对含量至少达40 % ，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1％或以上的类群能够通过DGGE检测到[5]。TGGE 仪器所允许的温度范围为15 ℃～80 ℃，较大片段DNA 的Tm 值因为接近80 ℃而使检测难度提高；若电泳条件不适宜，不能完全保证将有序列差异的DNA片段分开，从而出现序列不同的DNA 迁移在同一位置的现象。
3、高通量测序方法
近年来，16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600碱基的序列，足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[8]，因此454高通量测序的方法因其读长（400~500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不论是全长还是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。Gen Bank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于系统发育分析(phylogenetic analysis)。
高通量测序的优越性体现在：测序序列长，可以覆盖16S /18S rDNA、ITS等高变区域； 测序通量高，可以检测到环境样品中的痕量微生物；实验操作简单、结果稳定，可重复性强；无需进行复杂的文库构建，微生物DNA扩增产物可以直接进行测序，实验周期短；测序数据便于进行生物信息分析。
该方法得到顶级期刊的认可（Nature等），已成为土壤微生物多样性检测的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，为客户提供的土壤样本进行高通量测序并进行生物信息学分析。高通量测序因其数据量大，操作过程简单，尽可能避免了繁琐的实验操作过程所造成的样本损失，能够相对客观的反应出土壤样本的真实情况。
二、高通量测序在土壤微生物研究中的应用
1、 研究土壤微生物的物种多样性
微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性，或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成不同的功能群(function group)，通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的产甲烷细菌、固氮菌、根瘤菌等的多样性进行研究。以下是几篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454测序法对西半球的一个大的横断面的4类土壤进行检测和统计学评价。结果表明，这4种土壤中，最丰富的微生物类群拟杆菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而检测结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少，仅为该位点所有序列的0.009%，而农业土壤的比例则为4% -12%。
土壤中细菌的多样性差距非常大，因土壤结构的不同土壤中的细菌群体也呈现出多样化。Triplett等[10]基于焦磷酸测序法来对16S rRNA的V2-V3区域进行测序，估测9个草地土壤中的菌群的整体和垂直特性。对所有752,838条数据序列进行聚类分析，探索菌群在丰度、多样性和组成成分等方面的特异性。作者发现在不同的土壤层中，细菌系统发生的种群或者亚群的不同分配是与土壤的性质有关的，包括有机碳含量、总含氮水平或者微生物生物量。
2、研究土壤微生物功能多样性
土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S 等营养元素在土壤中转化相关的功能等, 通过分析测定土壤中的一些转化过程, 如有机碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等来了解土壤微生物功能。
氨氧化反应是硝化作用的第一步，也是全球氮循环中由微生物活动形成硝化盐的重要进程。Leininger[11]检测了3个气候区域12块原始和农业用地的土壤里编码氨单加氧酶(amoA)的一个亚基的基因丰度。采用反向转录定量PCR研究及无需克隆的焦磷酸测序技术对互补DNA测序，证实古细菌的氨氧化活性要远高于细菌，证实Crenarchaeota可能是土壤生态系统中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的环境转录组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信息。结果认为，通过该方法可以同时研究微生物生种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。群落基因组学分析可以通过研究微生物基因组序列与某些表达特征之间的关系，获得一些微生物功能方面的信息。但同时也需要运用其他方法将特定功能与具有这种特定功能的微生物群落结构对应起来。对rRNA表达基因和与环境因素相关的主要酶类的基因进行定量化和比较分析，将能了解微生物结构与特定功能之间的关系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是参与到氮流失和温室气体排放等氮循环过程的重要流程之一。通过宏基因组测序的方法，结合分子检测和焦磷酸测序，Ryan等分离鉴定了操纵编码反硝化过程的酶类。通过筛选77,000个土壤宏基因组文库中得到的克隆，最终分离并鉴定了9个参与反硝化作用的酶簇[13]。
3、 研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响
环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。Zachary等[14]以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。通过液相色谱/质谱（LC-MS），作者确定H218O中的氧原子结合到了所有的DNA结构成分中。尽管这种结合不是均匀的，还是可以明显的将标记了18O和未标记的DNA区分开来。作者发现DNA和细胞外的H2O中的氧原子在体外没有发生交换，表明掺入DNA的18O是相对稳定的，并且掺入到细菌DNA中的18O的比例较高（48-72h）。土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究和生态类群的划分。
2. 检测土壤中的微生物实验的土壤采集详细步骤
1、根据研究设计选择具有代表性的土壤，确定采样地。了解该地区的生物气候等情况，确定采样时间，避免雨季采样。
2、选择未经人为扰动的区域采样，耕地样品要在施肥前采集。
3、采样时要对土壤、生物、气候等环境因子进行调查记录，如地形、植被、土壤剖面结构、土壤水热状况、酸碱度、有机质含量等、
4、采样时所有工具、塑料袋或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭。
5、采样程序如下：除去地面植被和枯枝落叶；铲除表面1cm左右的表土；多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除石砾等杂质后再取一定量土壤装袋；取样深度依照研究设计而定，在同一剖面中分层取样时，应在挖好剖面后，先取下层土样，然后再取上层土样，以避免上下混杂。
3. 土壤微生物中的真菌DNA应用什么方法提取，提取应注意哪些细节~
CTAB法可以的，通用于真菌DNA提取，
第一步使用液氮研磨破壁，非常重要，后面都是抽提掉蛋白等杂质。
如果资金充足就购买试剂盒提取，速度快。
4. 求助提取土壤微生物总DNA的方法
植物提取物提取
目前提取植物提取物用溶剂提取、超声波提取、微波提取酶提取超临界流体萃取、微波辅助提取等则作新提取技术广泛使用
溶剂提取
溶剂提取用溶剂固体原料提取效所用溶剂必须具备与所提取溶质互溶特性植物材料粉碎放入适合容器内加入数倍量溶剂采用浸渍、渗漉、煎煮、流连续提取进行提取巴科丹参提取物用溶剂提取提取精油类物质用溶剂提取
溶剂提取提取工艺程溶剂浓度、料液比、提取温度、提取间直接影响效提取率Cristina Juan等通溶剂萃取提取米赭曲霉素A用荧光探测液相色谱确定OTA含量研究表明适宜料液比、提取温度提取间情况提取物OTA含量高4.17ng/gMonte D. Holt等采用溶剂萃取熟麦种提取烷基间苯二酚实验表明采用溶剂萃取能够节约提取间
超声波提取
超声波提取利用超声波产强烈振空化效应加速植物细胞内物质释放、扩散并溶解进入溶剂同保持提取物质结构物性发变化超声波提取原理主要物理程近逐渐受重视较新提取数说超声波提取较规溶剂提取能幅缩短提取问消耗溶剂少浸率高具较高提取效率
超声波提取工艺程溶剂选择浓度、料液比、提取温度、提取间直接影响提取率Ling Zhou等利用超声波提取提取五味主要研究超声提取率影响素实验研究提取率随着温度升高升高随着功率增增Hong Van Le等利用超声波提取樱桃维素E酚类化合物主要比较超声提取酶提取提取间、提取率差异实验结表明超声波提取间比酶提取缩短6倍超声波提取提取率酶提取2～3倍钟等利用超声波萃取鲜竹叶叶绿素用光光度计定量测定所萃取叶绿素含量结表明：与用机溶剂提取相比超声波萃取仅萃取率高、速度快、效率高且室温提取需加热节约能源
超临界流体萃取
超临界流体提取(supercriticalfluid extractionSFE)种较新型提取离技术般采用CO2作提取剂超临界流体萃取原理利用超临界流体独特溶解能力物质超临界流体溶解度压力温度变化非敏特性通升温降压手段（或两者兼用）超临界流体所溶解物质离达离提纯目兼精馏提取两种作用具性易失、产品质量高、提取离程同步完等优点认绿色环保高新离技术特别适合于稳定产物理性物质离与精制
20世纪80代期超临界CO2提取技术逐步应用于植物性提取离研究应用较功项新技术Ruey Chi Hsu等CO2乙醇溶剂采用超临界流体提取技术提取灵芝效研究结表明：超临界流体提取保证灵芝提取物流性且受温度影响Monica Waldeb.ck等采用加压流体萃取技术提取橄榄角鲨烯α-育酚两种实验结表明：溶剂乙醇、提取温度190℃、提取间10min提取效YI QI ANG GE等采用超临界CO2提取技术麦胚芽提取维素E主要研究提取前处理提取工艺条件产率影响实验研究表明：粒30网、压力4000～5000psi、提取温度40～50℃、CO2流体流速2.0mL/min提取率高
微波辅助提取
微波辅助提取技术（microwave.assistedextractionMAE）利用微波能提高提取效率种新技术微波辅助提取利用微波加热特性物料目标进行选择性提取通调节微波参数效加热目标利于目标提取与离微波辅助提取提取植物原理植物品微波场吸收量能量周围溶剂则吸收较少细胞内部产热应力植物细胞内部产热应力破裂使细胞内部物质直接与相冷提取溶剂接触进加速目标产物由细胞内部转移提取溶剂强化提取程微波辅助提取技术原理与浸泡滤使用热能提取植物提取物速度却要比传统快减少提取间同避免价值植物提取物破坏降解
目前微波辅助提取其快速提取速度较提取物质量植物性提取力工具微波辅助提取选择性内加热且要求处理物料具良吸水性换言待离产物所处位置容易吸水否则细胞难吸收足够微波自身击破产物难迅速释放于液体提取体系要求溶剂物质具极性非极性溶剂微波作用敏Ti ng Zhou等采用微波辅助提取提取药用植物提取黄酮类香豆素类化合物通交实验研究品、料液比、提取温度间提取率影响实验研究表明：佳提取工艺条件提取率98.7%黎海彬等用微波辅助提取提取干罗汉罗汉皂苷结显示微波辅助提取提取率70.5%比规水提取高45%间缩短50%
微波超声波协同提取
微波种非电离电磁辐射辐射物质极性微波电磁场快速转向及定向排列产撕裂相互摩擦引起发热保证能量快速传递充利用具高效节能工业污染等优点微波穿透深度限（与其波同数量级）且强化提取程传质功能并显着超声波种高频机械波具湍效应微扰效应界面效应聚能效应等超声波所产热效应显着且局限空化泡周围极范围两者结合起协同作用利于破壁组释放等即通微波－超声波协同强化提取技术获取种高效价廉污染物性物质提取HeJT等采用微波－超声场协同药提取水溶性物性均取较效罗锋等采用微波超声波协同提取甘草提取黄酮马利华等研究传统蒸馏与微波超声波协同提取牛蒡类胡萝卜素提取率影响并通交实验确定佳提取条件白红进等别水乙醇蒸馏水及水乙醇－蒸馏水(体积比1∶1)等溶剂采用微波超声波协同提取芦荟并采用食用油氧化稳定性测定仪别测定提取物菜籽油猪油棉籽油及葵花油抗氧化作用
酶提取
植物细胞壁由纤维素构其植物效往往包裹细胞壁内酶提取利用纤维素酶胶酶蛋白酶等（主要纤维素酶）破坏植物细胞壁促使植物效限度溶解离种酶提取提取工艺酶选择、酶浓度、pH值、酶解温度、酶解间都影响植物提取物提取率
E. BARZANA等采用酶提取万寿菊提取类胡萝卜素主要研究料液比、酶浓度、酶解间温度等提取率影响研究结表明佳提取工艺：料液比1∶4、酶浓度0.3%、提取间1.5h、温度25℃张清等采用酶提取提取银杏性—黄酮并通交实验找酶浓度、pH值、酶解温度间等影响提取率佳工艺条件
5. 土壤总DNA提取的方法，详尽说明，最好列出注意事项，谢谢
土壤总DNA的几种提取方法
SDS 高盐法(方案1)
具体步骤:
称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末;
将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r•min - 1振荡30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r•min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次;
用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r•min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r•min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中.
变性剂加SDS 高盐法(方案2)
具体步骤：
取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次;
转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r•min - 1 离心10 min ,取上清;
在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r•min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r•min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀.
SDS-酚氯仿抽提法（方案3）
称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。
冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）
取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻璃珠旋涡5~10 min，在液氮中冷却1 min后迅速在沸水中煮2 min，如此重复3次，13 000r/min离心10 min。上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50ul,轻轻混匀后，37C温浴30min，再加入250ul SDS 缓冲液（100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0）,上下颠倒10min，13000 r/min离心10min,收集上清夜。
二、DNA纯化
葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化
取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50ul粗土壤DNA，以10 min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。层析液浓缩至50ul
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
证明存在DNA。
四、DNA 的纯度和定量检测
用紫外分光光度计测量纯化后的DNA 溶液在波长为230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值，分别算出A260/A230及A260/A280值。来估计DNA的纯度。
五、纯化后土壤DNA 的PCR扩增
PCR 反应体系为50μL ,模板为1μL 。PCR反应引物（放线菌通用引物）:
反应条件: 94 ℃ 3 min 预变性; 94 ℃ 1 min , 56 ℃1 min ,72 ℃1 min ,30 个循环;72 ℃补平5 min。PCR 产物用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
六、检测扩增结果
凝胶电泳，用溴乙锭染色，在紫外光下检查结果。
6. 土壤微生物的检测怎么做，哪里可以做
土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，严格意义上应包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有几亿到几百亿个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机物的分解和养分的转化；那土壤内的微生物如何测定呢，下面喆图小编带大家来了解一下。
一、培养方法
（1）稀释平板涂抹法
具体操作如下：
①准确称取 10g（精确到 0.001）采集的鲜土，倒入装有 90 ml 无菌水的 500 ml 的三角瓶中，置于往返震荡机上（120r/min，常温），震荡 20 min，使土壤充分分散成为土壤悬液。
②将上面的土壤悬液用无菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀释液中，即为 10-2稀释度，依次按 10倍法稀释，制成 10-1~-~10-6稀释度。注意:每次吸取悬液时,在稀释液中反复吸入和吹出 3-~5 次,减少因管壁吸附而造成的误差,并使悬液进一步分散,每个稀释度需要更换无菌吸管吸取悬液。)
③根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度的悬液接种。本实验选择细菌的稀释度为 10-~10-5,放线菌为 10~-10-4,真菌为 10-1~-10-3。 -3-2
④土壤悬液的接种方法:在无菌培养皿中倒入 15~20 ml 选择性培养基,待凝固后,用 0.2 ml无菌移液枪吸取0.2 ml各稀释度的土壤悬液,然后立即用涂抹棒将悬液均匀的涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种时,从高稀释度开始,依次接种到低稀释度。
⑤接种了土壤悬液的培养皿,平放在超净工作台 20~30 min,使得菌液渗透入培养基内,然后倒置于 28~-30°C 生化培养箱中培养一定时间:细菌 1~-3 天,放线菌 10-~14 天,真菌 3~-7 天。
⑥培养结束后,取出培养皿计数。
(2)稀释培养法
一系列稀释度的制作与稀释平板法相同。根据各类微生物在土壤中数量的多少选择适当的稀释度,分别接种 1 ml 稀释液与制作好的液体培养基中,根据需要做 3~4 次重复,适温培养。2 三大类土壤微生物培养基的分离三大类土壤微生物的分离采用稀释平板涂抹法,每个菌种要求做 3 个稀释度,每个稀释度做3-4次重复,选取细菌和放线菌的菌落在20~-200之间的培养皿、真菌的菌落在 10-~100 的培养皿计数,并计算三次重复的平均值。每克干土中微生物数量计算式:
每克干土中菌落数=(菌落平均数×稀释倍数×100%)/(湿土质量×干土)
1, 细菌:牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 3g、蛋白胨 5g、琼脂 18g、蒸馏水 1000 ml、pH 值 7.0-~7.2 。
2, 放线菌:改良高氏 1 号培养基:KNO3 1g,FeSO4·7H2O 0.01g,K2HPO4 0.5g,淀粉 20g,MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、琼脂 18g、3%重铬酸钾溶液 3.3ml、蒸馏水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4
3,真菌:马丁氏培养基(虎红琼脂):蛋白胨 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、琼脂 18.5g、孟加拉红 0.033g、氯霉素 0.1g、蒸馏水 1000ml。
所有培养基需在湿热灭菌锅中121°C灭菌 20-~30min
以上土壤微生物测定方案仅供参考，可以查询专业公司进行检测。
7. 土壤微生物做高通量 土壤dna浓度应该是多少
计算土壤微生物数量，常见的有两种方法，一种是传统的培养法，即平板法，将一定质量的土壤制成悬浮液，稀释后涂到培养基上，培养18-24h，在显微镜下找菌落数目，乘以稀释倍数，粗略估算细菌数量。但这种方法只能得到可培养的微生物数目，仅占土壤总细菌的1%，另外99%的微生物是不可培养的，用这种方法得到的值只是参考数值；
第二种方法是高通量测序的方法，提取土壤总DNA，通过测定土壤中所有DNA的碱基序列，与细菌的碱基序列数据库比对，得到细菌的名称（操作分类单位，OTU），根据序列的条数大概估算这类微生物所占的比例。但这种方法无法区分死亡的细菌和活着的细菌，也有一定的局限性。
8. 土壤总DNA有哪些提取方法
SDS 高盐法(方案1)
具体步骤:
称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末;
将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次;
用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中.
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9. 关于土壤细菌基因组DNA做PCR的问题！！！
Mmmmmm，这个问题啊，从你的描述确实是模板的问题了，导致PCR失败的模板问题无非两种：浓度和纯度，LS的兄弟说的不错，模板浓度太大不行，稀释做个梯度看看也许管用；另一方面，纯度的控制就没这么简单了，从土壤中提取的基因组中包括肯定不止一种微生物的DNA，对任何一种微生物DNA来说，其他微生物的DNA都算是杂质而且无法去除，同时氛氯仿法提取的DNA通常纯度不会太高，尤其你的介质又是土壤，难免有其他杂质除不干净，建议你用试剂盒纯化一下你的模板，我常用的纯化基因组的试剂盒是OMEga的PCR产物纯化试剂盒，其实对模板进行稀释，也就是对杂质进行稀释，以期达到一种平衡，使得模板能够作用而杂质不起作用，希望对你有帮助吧，另：我不是做广告的
10. 我现在提土壤总DNA,DNA提不出来，可是用16srna可以扩出来，这是怎么回事呢
你怎么知道提不出来？提DNA时有没有DNA被提取出来不能用眼睛判断，即便用分光光度计测量或用电泳后染色也不一定行，主要要看土壤中的DNA的量的多少，PCR的灵敏度很高，因此只要有极其微量的微生物DNA，就能扩出来，当然你要排除是污染的。