微生物的分离包含哪些步骤

A. 自然界分离微生物的一般操作步骤是什么

先确定要分离的微生物的种类
然后选取合适的选择性培养基
然后接种，可以用直线，也可以用曲线法，然后在适合条件下培养，
重复几次直至得到纯的菌落

B. 微生物纯种分离的方法有哪些

自然界中的微生物总是杂居在一起 即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物 要研究其中某一种微生物 首先必须将它分离出来 下面介绍几种纯种微生物的分离方法
平板划线分离 将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板 用接种环沾取少量待分离的材料 在培养基表面平行或分区划线（图5-5）然后 将培养皿放入恒温箱里培养 在线的开始部分 微生物往往连在一起生长 随着线的延伸 菌数逐渐减少 最后可能形成纯种的单个菌落
液体稀释法 将待分离的样品经过大量稀释后 取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面 培养后就可能得到单个菌落
利用选择培养基进行分离 不同的微生物对不同的试剂 染料 抗生素等具有不同的抵抗能力 利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基 用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的
菌丝尖端切割 这种方法适于丝状真菌 用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端 将它们移到合适的培养基上培养后 就能得到新菌落

C. 选择性分离微生物育种的步骤大致有哪些

一、微生物工业对菌种的要求

(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;

（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;

（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;

（4）能够高效地将原理转化为产品;

（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;

（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;

（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;

（8）具有抗噬菌体的能力；

（9）遗传稳定性，

二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；

（2）从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

（二）微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程

（1）新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下：

标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏

①采样

采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

②标本预处理

④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。

⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，

⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。

2、菌种的分离方法

（1）施加选择性压力分离法

主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

（2）随机分离方法

有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。

A、抗生素产生菌的分离

抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。

Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离

抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。

B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。

Ｃ、生长因子产生菌的分离

以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中。

D. 如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体

首先你需要确定你分离的是什么微生物，然后按照以下步骤
1.
选择合适的富集培养基，加入土壤把目标菌属富集
2.
选择合适的选择性培养基把目标菌属分离出来。
3.
通过稀释平板涂布，培养三天后，观察不同的菌落，在平板反面用记号笔编号不同的菌落。
4.
把标记的菌落在培养基上划线分离，每一个编号划线三个平板
5.
待平板长出单菌落后，显微镜镜检，观察目标菌是否单一。
单一菌落即为微生物的纯培养体。

E. 从自然界分离筛选微生物菌种的基本程序包括哪些

⑴采样:从适合微生物生长的环境采样
⑵富增:根据其特性选择性的富集目的微生物
;⑶初筛:采用平板对富集的目的微生物纯种分离,确定其活性选出高产菌种,一般200株;
⑷复筛:对第一次分离的微生物菌种,再次筛选,一般40株;
⑸二级复筛:从40株选出5株⑹确定菌种,进行生产性能测定.

F. 微生物分离实验

：

从复杂的
群体中获得只含有一种或某一株
的过程称为
的分离与纯化。常用的方法有
1、简单
挑取法
2、平板分离法
此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：
1、在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、
、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种
造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2、微生物在
上生长形成的单个
可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取
而获得
。获得
的方法可通过稀释
平板或平板划线等方法完成。
但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个
并不一定保证是
。因此，
的确定除观察其
的特征外，还要结合
检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的
，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微
的重要场所，是发掘
的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的
。此实验将从土壤中分离两种细菌。

实验器材、试剂与
：
1、器材：

、
、
、
、
、
、
、
、三角瓶、
、
、
、
、
杯、
、高温
、
（枪头）、
、
、
等。
2、 试剂：
配制

的原料（
、NaCl、
、
）、配置糖
的原料（
、K2HPO3、
、
、NaCl、
）、
（
）、
染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％
染液、0.5％番红水染液、3％
水溶液、1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、
等。
3、 土样：取自
7号宿舍楼门前土壤，地下10cm左右。

实验步骤：
1、配制
蛋白胨
：
1）配制
500ml （用于12个平皿和10支试管斜面）
牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g
蛋白胨 1% …………………………………… 5g
NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g

2% …………………………………… 10g
pH ………………………………………… 7.0~7.2
2）倒12个平板和10支试管斜面，包扎，121℃灭菌20min.
2、制备土壤
：
称取土样10g，放入盛有100ml
的带有
的三角瓶中，振荡摇匀10min 使土和水充分混合，然后用
从三角瓶中吸取1ml（此操作要求
），加入另一盛有9ml
的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001不同
的土壤溶液。
3、
培养：
以0.01以及0.0001两个浓度的土壤
作为

的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨
中，共6个培养基，标号，37°C温箱培养48 h。
4、划线分离（划线培养）：
对两种土壤溶液的
基进行观察，记录两种区分明显的细菌性状。挑取此两种细菌在新的培养基中划线培养（每种
3个
），标号、37°C培养。
5、初步鉴定：
对两种菌进行简单染色、
以及
观察，记录结果。
6、试管斜面再培养：
将两种纯
接种分别接种在5支试管中，共10支试管。37°C培养（18－24h）。
7、对试管中培养的两种菌进行生理生化鉴定：
1）
鉴定：
A
：

与许多
与其他细菌区分的主要依据是鉴定有无
。该酶可以把
分解为水与氧气，气体氧以气泡跑出来，则为
实验阳性。
和许多
在
酶实验中呈现阴性。
B 步骤：
将培养新鲜的待测
（培养18－24h内）接在
上，滴一滴3％过
于菌体上。
2）糖发酵与氧化实验
A
：
在细菌的分类鉴定中，糖发酵与氧化测定是一项重要的依据。绝大多数细菌都可以利用糖类作为能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的发酵与氧化的能力就有所不同。有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不可以产气。酸的产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可以由预先加在培养基中的
（
水溶液）呈现出来。这样把接好
的培养基放在
或好氧的环境下培养，培养基有绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定。
B 步骤
① 配置糖
150 ml （
：、K2HPO3：、
、琼脂：、NaCl：、蛋白胨：），分装试管。
② 110°C灭菌培养基20 mins （同时灭菌一定量
，待用）。
③ 对两种细菌进行“穿刺”培养，每种菌做5个试管：2个盖管培养，2个开管培养，一个为盖管
。在培养基的上方加入1－2cm厚的
，作为“盖 管”，以提供菌体无氧的生长环境，开管则不加甘油，作为有氧的生长环境供菌体生长。
④ 在37°C下培养，并在培养24h后观察培养基中颜色的变化，以及有无气泡。
3）
测定
A 实验原理

是
的一种，它在有分子氧以及
存在时，可以氧化二甲基对苯撑二胺，使之呈现
或暗红色，在此基础上还可以与a－
结合生成
酚兰，出现蓝色
B 步骤
在干净
中放一
，用火柴棒取培养18－24h的鉴定菌苔黏在
上，滴一滴1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液于菌苔上，进行观察。

G. 微生物分离方法

微生物分离法是获得微生物纯培养物的一种分离方法。通过这个方法可实现一种微生物的培养，或获得一个细胞的后代。其具体方法有：

1、稀释倒平皿法。将待分离的材料作一系列稀释，取不同稀释度适量涂布于固体培养基平板上或与已熔化的固体培养基一起倾注入平板内，经过培养即有一个微生物细胞繁殖来的单个菌落。

2、划线法。先将已熔化的固体培养基制成平板，待凝后，取分离材料在上面划线，可作平行划线、扇形划线或其他形状的连续划线，使菌样逐渐减少，最后得到单个孤立的菌落。

(7)微生物的分离包含哪些步骤扩展阅读：

微生物分离技术的应用措施：

1、减少毒性氧物质的毒害作用：由于常规培养方法使用的高浓度营养基质不利于微生物生长，适当降低营养基质的浓度可以减弱这种不利影响。发现低浓度基质的培养基培养出的细菌在数量和种类上均多于高浓度基质的培养基，但营养浓度过低时会使培养出的微生物数量反而下降。

2、维持微生物间的相互作用：在培养基中加入微生物相互作用的信号分子就可简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求。

3、供应新型的电子供体和受体：不同微生物的代谢过程不同，因此对反应的底物要求也不尽相同。供应微生物需要的特有底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。大量的研究表明，将新颖的电子供体和受体应用到微生物培养中，能够发现未知的生理型微生物。

4、分散微生物细胞：自然界中很多微生物聚集生长，形成“絮体”和“颗粒”等，致使其内部的微生物不易被培养。对“絮体”和“颗粒”进行适度的超声处理，将细胞分散再进行培养，可以使更多的微生物接触培养基而得到培养。

5、延长培养时间：对“寡营养菌”的培养，可适当延长培养时间，使其能长至肉眼可见的尺度。当然培养时间不能无限增长，因为培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高[4]。

6、利用琼脂替代物：琼脂对某些微生物具有毒性作用，采用无害且凝结作用较好的替代物质作为培养基固化剂，可以增加微生物的可培养性。

H. 葡萄腐烂微生物的分离怎么做

微生物分离法是获得微生物纯培养物的一种分离方法。通过这个方法可实现一种微生物的培养，或获得一个细胞的后代。其具体方法有：
1、稀释倒平皿法。将待分离的材料作一系列稀释，取不同稀释度适量涂布于固体培养基平板上或与已熔化的固体培养基一起倾注入平板内，经过培养即有一个微生物细胞繁殖来的单个菌落。
2、划线法。先将已熔化的固体培养基制成平板，待凝后，取分离材料在上面划线，可作平行划线、扇形划线或其他形状的连续划线，使菌样逐渐减少，最后得到单个孤立的菌落。
微生物分离技术的应用措施：
1、减少毒性氧物质的毒害作用：由于常规培养方法使用的高浓度营养基质不利于微生物生长，适当降低营养基质的浓度可以减弱这种不利影响。发现低浓度基质的培养基培养出的细菌在数量和种类上均多于高浓度基质的培养基，但营养浓度过低时会使培养出的微生物数量反而下降。
2、维持微生物间的相互作用：在培养基中加入微生物相互作用的信号分子就可简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求。
3、供应新型的电子供体和受体：不同微生物的代谢过程不同，因此对反应的底物要求也不尽相同。供应微生物需要的特有底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。大量的研究表明，将新颖的电子供体和受体应用到微生物培养中，能够发现未知的生理型微生物。
4、分散微生物细胞：自然界中很多微生物聚集生长，形成“絮体”和“颗粒”等，致使其内部的微生物不易被培养。对“絮体”和“颗粒”进行适度的超声处理，将细胞分散再进行培养，可以使更多的微生物接触培养基而得到培养。
5、延长培养时间：对“寡营养菌”的培养，可适当延长培养时间，使其能长至肉眼可见的尺度。当然培养时间不能无限增长，因为培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高 [4] 。
6、利用琼脂替代物：琼脂对某些微生物具有毒性作用，采用无害且凝结作用较好的替代物质作为培养基固化剂，可以增加微生物的可培养性。

I. 自然界分离微生物的一般操作步骤

自然界的微生物，几乎都是混杂在一起的。人们要想观察、研究和利用某一种微生物，就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来。所以微生物的分离是一项十分重要的技术。

一、分离的基本方法

微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。

1.连续稀释分离法

①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。

②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。

③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。

④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。

⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。

2.平板划线分离法

①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。

②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。

③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。

二、各类微生物的分离

1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌

其分离方法见本节“分离的基本方法”

2.从土壤中分离放线菌

①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

3.从土壤中分离霉菌

①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。

②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。

4.从饮水中分离大肠杆菌

①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。

③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。

④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。

⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。

J. 自然界分离微生物的一般操作步骤土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择产品的鉴定

1、采集土样
2、称取合适量，加水，静置30min
3、取上清液1ml进行梯度稀释
4、取合适梯度涂平板（按照自己要分离的菌选择培养基），每个做3个平行
5、培养，观察，鉴定菌种