1. 微生物的实验室培养 倒平板操作 平板划线法
其目的是一样的：
1、防止杂菌掉落（最关键）
2、水气是往上蒸发的，可以减慢其干燥速度。
2. 微生物平板菌落计数法具体实验步骤
一、目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定(如杀虫菌剂),生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁,而且测定值常受各种因素的影响。
三、器材
大肠杆菌悬液,牛肉膏蛋白胨培养基, 1ml无菌吸管,无菌平皿,盛有4． 5 ml无菌水的试管,试管架和记号笔等。
四、操作步骤
1．编号：
取无菌平皿 9套,分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀释
用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出时,管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中,吸吹三次,……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。
3．取样
用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml,对号放入编好号的无菌培养皿中。
4．倒平板
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml,置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置于37℃温室中培养。
5．计数
培养24小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算：
每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5
一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。
平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要的,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
平板菌蓓计数法的操作除上述的以外,还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同,所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于 37℃温室中烘烤30分钟左右,使其干燥,然后用无菌吸管吸取 0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上,再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上20—30分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于37℃的温室中培养。
五、实验报告
1．结果
将计数结果填入下表。
2．思考题
(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？
(2)要使平板菌落计数准确,需要掌握哪几个关键？为什么？
(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数,所得结果是否一样？为什么？
(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。
3. 跪求 土壤微生物的测定：涂布平板法 测定细菌、真菌和放线菌的实验步骤（详细）
涂布平板法实验器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制 牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1g
氯化钠 0.5g
琼脂 2g
自来水 100mL
pH 7.0～7.2 灭菌 1.05kg/cm2，22min
配制具体步骤
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。
2．溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。很多都是不需要过滤的。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。
分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）
3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。
四、实验方法
1．样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。
图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。
2．平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
4. 食品微生物检验中的大肠平板菌落数的选择，选取菌落数在15到150之间，应怎么做呢
1：指的是一个稀释级别平板的平均数
2：是从同一稀释度中共选取10个可疑的菌落..（再这里我也要打个疑问：会有10个可疑的菌落这么多吗？？）
3：选取菌落数10～150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。稀释度选择及菌落数报告方式可参考菌落总数测定的报告方式。
5. 食品微生物检验中的平板菌落数的选择，选取菌落数在15到150之间，应怎么做呢
（1）首先，我们写报告选取的菌落数在30~300CFU，03版的和2010版的国标都是这么规定的，我不知道你们为什么选15到150。其次，出现的典型和可疑大肠菌群菌落数是指一个稀释级别的两块平板的菌落数的平均数。举例：如果有一个超过了150，而一个没有超过，有两种可能，第一，你的实验中受到了污染，或者说加样品稀释液的量少了。解决方法，实验前要确保实验的整个流程都是无菌的，实验的环境是否紫外消毒，通风情况，样品打开前是否对包装进行75%酒精消毒，是否点酒精灯，实验穿的白大衣是否经紫外照射，实验时是否带口罩，脚套，头套；加稀释液的时候应 用枪（微量移液器）加样。第二说明你选的这个范围无法弥补实验中产生的误差，简单的说你可以选30~300CFU进行报告。
（2）指的是一个稀释级别的2个平板共移种10管，每个板子5管。至于你说的3个稀释级别问题，你可以想一下，加入第一个稀释级别是150cfu，第二个就应该在15cfu左右，第三个就该是1~2cfu左右，不在15~150cfu之间啊，你没必要报告它呀，只需报前两个稀释度的。所以，一般做实验只用作两个稀释度的就行了。
6. 如何制作微生物培养皿
一、如何制作：
分离培养微生物，离不开固体培养基。在微生物实验室里，固体培养基的使用是如此地频繁和常规，以至于这一方法看起来也理所当然。然而，回溯至1881年固体培养基出现以前，微生物的培养还只能在液体培养基中进行。为了能直接观察培养物的形态及生长情况，科学家希望能将微生物培养在固体表面上，就像微生物生长在橘子皮或薯仔上一样。德国医生罗伯特·科赫（Robert·Koch，1843—1910）曾用煮沸消毒的薯仔来培养细菌。此后，他试着用明胶作培养基的凝固剂。他将明胶加入液体培养基中进行融化，然后将混合均匀的液体缓慢地倒在一块玻璃板的表面。当明胶冷却凝固后，就在玻璃板表面形成一层固体培养基。为了防止空气中杂菌的污染，科赫还用玻璃罩将玻璃板与周围环境隔离开来。但是，人们很快发现，明胶在20 ℃以上就变软了，很难进行分离微生物的划线操作。在温度高于25 ℃时，明胶就液化了，而大多数细菌的培养温度都不低于25 ℃。
二、培养皿的定义：
培养皿是一种用于微生物或细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。培养皿材质基本上分为两类，主要为塑料和玻璃的，玻璃的可以用于植物材料、微生物培养和动物细胞的贴壁培养也可能用到。塑料的可能是聚乙烯材料的，有一次性的和多次使用的，适合实验室接种、划线、分离细菌的操作，可以用于植物材料的培养。
7. 微生物实验室培养后的平板及培养物(大量)怎么处理
大量培养物的话最确保的是高压湿热灭菌处理，记得要将有琼脂的一面置于底部，不然高温会融化琼脂，结果是可以想象！灭菌后还需要用新洁尔灭重新平皿后晾干
8. 微生物实验平板制作方法
（1）培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。分为液体培养基和固体培养基。
制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
（2）常用消毒方法：煮沸消毒法、紫外线照射、巴氏消毒法和化学药剂消毒。
（3）常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。
培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。
（4）平板培养基的制备：计算、称量、融化、灭菌、倒平板。
（5）接种方法：平板划线法和稀释涂布法。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
9. 微生物研究中的传统平板法是什么方法具体怎么做的
传统的平板法为：稀释混合倒平板法
平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许 (0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。
于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。