化学键合相用于哪些LC中

㈠ 高效液相色谱中固定相分类最常用的是哪类

高效液相色谱柱大致可分为五类:一、高效反相液相色谱柱 以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、方法验证(validation)的心脏! 高效反相液相色谱柱也极其广泛应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域! 高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一! 无论是过去，现在和可预见的未来, 以球形B型硅胶(5um 或 3um)为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中永远占有统治地位!常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80%以上的应用。 过去数十年来, 无数努力集注于: 1) 改善硅胶的品质, 优化键合化学; 2)开发新颖的材料骨架替代硅胶。十多年前, 使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命! 生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。无机A型硅胶重金属含量很高, 硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。球形B型硅胶重金属含量很低, 在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料, 导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃!然而，另一方面，基于客户的大量反馈和我们对几乎所有色谱厂商产品的评估, 我们相信键合化学问题没有获得很好的解决。具体体现在:
(1) “纯粹”反相机理的键合相例如C18和C8市场上仍然是单功能，三功能和聚合物键合相"鱼目混杂"。 (2) 键合相封端问题没有获得很好的解决, 一直是困扰色谱领域最大的问题! 迄今为止全部的尝试只获得有限的成功。
(3) 极性嵌入式(Polar embedded)键合相
极性嵌入式(Polar embedded)键合相是C18高效反相液相色谱"卫星群"中最重要的产品, 是C18和C8键合相最重要的补充。
极性嵌入式(Polar embedded)键合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个C16酰胺。 那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群的主要问题是什么? 极性嵌入式键合相和所谓的水相C18主要问题是键合相泄漏, 键合相不稳定等。两者之间的内在差异是: 极性嵌入式键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题能够获得很好的解决, 但使用极性硅烷试剂封端的所谓的水相C18键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题是不可逆转的。 在类似C18链长度的硅烷试剂中嵌入极性酰胺或酰酯, 使得键合相亲水, 在100%水相条件下稳定。但按照类似C18的键合化学, 键合覆盖率低, 键合相不稳定。 Chrom-Matrix InnovationTM PEG键合相是非常极性的产品, 但测试结果表明: PEG键合相非常稳定, 在LC-MS测试中没有检测到泄漏。这一成功和我们在胶体与界面科学领域的长期经验帮助我们成功开发了新型催化条件下新的键合化学。加上超临界流体技术封端, Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相比那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群稳定得多。色谱柱产品质量和寿命有质的飞跃! 即使这样, LC-MS测试显示: Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相仍然有非常低的泄漏。(4) 无泄漏低孔和高比表面积C18键合相等是小分子化合物分离纯化的终端保证!制备型高效反相液相色谱柱, 制备型高效正相液相色谱柱, 制备型高效离子交换色谱柱和对应的闪光色谱(flash chromatograpy) 是小分子化合物分离纯化最重要的终端保证!但是市场上大多数色谱产品和闪光色谱(flash chromatograpy)键合相有明显的泄漏。尽管泄漏在紫外可见检测器中是看不见的, LC-MS信号非常明显! 最重要的是泄漏的硅烷实实在在洗脱到顾客的终端纯化产品中, 而且没有考虑在内。

Chrom-Matrix公司成功地解决了上述所有问题! InnovationTM所有反相高效液相色谱产品都使用B型球形硅胶合成, 使用最优化个性化合成工艺, 使用超临界流体封端, 使用LC-MS/MS和表面电荷滴定等多种独特技术配合多种色谱测试保证产品的品质和批次重现性。其中大部分产品LC-MS/MS测试无泄漏, 极性嵌入式(Polar embedded)键合相非常低的泄漏。二、高效正相液相色谱柱 正相液相色谱是最早的色谱模式。直到现在, 合成后通过硅胶柱做进一步纯化仍然是有机化学家日常工作的一个重要组成部分。在理论上, 几乎所有的溶于正己烷，乙酸乙酯或异丙醇的有机化合物都可以用高效正相液相色谱分析。但在实际应用中，高效正相液相色谱的应用比高效反相色谱少得多。这是因为正己烷, 乙酸乙酯没有像水，甲醇或乙腈那样受欢迎。此外, A型硅胶正相液相色谱给客户一个惯性思维: 高效正相液相色谱的平衡时间很长。事实上, 高效正相液相色谱在制备规模的色谱纯化中一直发挥了重要作用。这是因为:(1) 高效正相液相色谱比高效反相色谱柱压低得多。(2) 高效正相液相色谱用的溶剂例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通过旋转蒸发除去。(3) 吡咯等蒸发性溶剂彻底改善了碱性有机化合物在B型球形硅胶, Diol和PEG正相液相色谱柱上的峰形。此外, 不管制备规模或分析测试,(1) 结构异构体分离分析必须使用正相液相色谱或超临界流体色谱。(2) 环境中腐殖酸的结构鉴定必须使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然后使用正相液相色谱或超临界流体色谱。这种小分子聚集的自然现象一定相当广泛。PEG正相液相色谱键合相等将让客户重新评估高效正相液相色谱的价值。三、高效亲水液相色谱柱 高效亲水液相色谱是一个介于正相和反相高效液相色谱之间的运作模式。这个模式最早来自NH2色谱柱的糖分析应用。在此之后，逐步在Diol, 硅胶和亲水性高分子键合相找到了一些有价值的应用。近年来，高效亲水液相色谱成为比较流行的色谱的运作模式, 主要是因为亲水性化合物有良好的保留和高效亲水液相色谱在LC-MS/MS中的应用。尽管如此，迄今为止没有权威的论文, 评论和教科书揭示了高效亲水液相色谱真正的价值和局限性。近年来，我们帮助客户采用高效亲水液相色谱的运作模式成功地开发和验证了数以百计的HPLC和LC-MS/MS应用。我们总结出:(1) 高效亲水液相色谱是LC-MS/MS应用的第一选择。请参阅我们的LC-MS/MS产品手册应用案例。(2) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水液相色谱仅可用于分析，而不是制备规模的分离。(3) 高效亲水液相色谱流动相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他调节), 流动相B是水(pH值用少量的甲酸或其他调节)。化合物洗脱秩序类似于正相液相色谱, 疏水性化合物首先洗脱, 然后是亲水化合物。流动相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有机溶剂。(4) 进样体积太大会导致一些峰值扭曲或分裂。柱承载能力通常是非常小的。(5) InnovationTM TX, HP Amide, Silica三种高效亲水液相色谱覆盖99 ％以上的应用, NH2色谱柱用于简单糖分析应用。(6) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水高效液相色谱柱柱效不如正相和反相高效液相色谱。四、高效强阳离子交换液相色谱柱 离子交换液相色谱是生物分离最常见最有用的一种色谱模式。另一方面，小分子分离分析极少使用高效离子交换液相色谱。这是因为:(1) 新颖的反相和多功能键合相例如InnovationTM Polar-Embedded Stable Amide和TX连续出现, 在很大的程度上补偿了常规C18键合相的缺点。 C18, C8键合相也有重大进展。高效亲水液相色谱柱也覆盖了许多分析应用。(2) 相比之下, 硅胶基质的高效离子交换键合相近几十年来产品质量没有取得质的突破。硅胶基质的高效离子交换键合相柱寿命普遍短, 疏水相互作用明显。(3) 聚合物基质的高效离子交换键合相在生物分析上面的应用比较广泛, 但其柱效过低，表面积太小，对小分子分离分析难有吸引力。 科学发明往往来自现实世界的挑战! 在对海洋毒素, 微生物代谢产物和天然植物(包括中草药)有效成分的分离纯化过程中, 我们深深感到高质量的硅胶基质的高效离子交换键合相是必不可少的! 因此，我们开发了硅胶基质的SCX, WCX, DEAE和SAX高效离子交换键合相。五、InnovationTM高效多功能液相色谱柱我们介绍四种高效多功能液相色谱柱:(1) InnovationTMTX毒品分析HPLC柱 InnovationTM TX毒品分析HPLC柱是实际应用中最有价值的一种色谱柱。由于其在毒品分析上出色的表现, DEA专家称它毒品分析HPLC柱。InnovationTM TX是一个多功能色谱柱, 具有反相, 弱阳离子离子交换, 亲水等作用, 能够使用在100%水相或100%有机相。由于它的弱阳离子离子交换机理, InnovationTM TX对碱性化合物的分离效果是所有色谱柱中最好的。它对碱性化合物有完美的峰形。它的绝对柱效和反相色谱分析柱相同的，甚至优于反相, 远胜传统的亲水色谱分析柱。(2) InnovationTM DNPH HPLC柱 InnovationTM DNPH HPLC柱主要用于环境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析应用中, 任何其他色谱柱没有它优越的选择性。(3) InnovationTM PAH HPLC柱 (4) 血浆，血清直接进样的InnovationTM PEG色谱柱 限制进入键合相(Restricted access media)最早由Merck公司发明。一个典型的方法是首先制造Diol键合相, 然后通过酰酯或酰胺反应嵌入疏水链。硅胶外表面的酰酯或酰胺链使用酶切断开。但酶不能扩散到内表面。由此外表面亲水, 内表面疏水。血浆，血清, 尿样可以直接进样。蛋白质等生物流体通过亲水外表面时没有保留, 小分子化合物可以扩散到内表面通过反相保留最后洗脱。限制进入键合相(Restricted access media)在学术领域比较欢迎, 但随着固相萃取产品的发展, 在工业领域的应用相当少。 但我们最后发现, 血浆，血清, 尿样可以直接进样的限制进入键合(Restricted access media), 尤其是InnovationTM PEG色谱柱在药物代谢领域具有独特价值。药物代谢研究, 尤其是全盲条件下的早期药物代谢研究, 追求绝对回收率! 一种药物代谢之后, 打破成许多小分子化合物。全盲条件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代谢产物。最理想的方法是, 血浆，血清, 尿样可以直接进样, 每毫升收集液使用14C同位素检测, 然后建立一个明确的代谢概况。 InnovationTM PEG色谱柱是一种多功能色谱柱。它是最好的正相色谱柱! 同时，使用乙醇取代储存溶剂后, 它能够被用来作为反相让血浆，血清, 尿样可以直接进样。

㈡ 什么是色谱的键合固定相

化学键合相色谱采用的是硅胶作为载体，然后通过烷基化，硅烷基化等，形成Si-O-R/Si-R/Si-O-SiR3等链，附在载体的表面，提高了固定相与流动相之间的相互作用力。根据极性的不同又可以分为正相色谱（固定相极性大）和反相色谱（流动相极性大）。
机械涂布固定液是将固定液直接涂布在载体（如玻璃微粒）表面，依靠的是固定液的浸润性等因素，而与化学键的作用力无关。

㈢ 什么是正相键合相色谱法什么是反相键合相色谱法

正相键合相色谱法
1. 氰基与氨基化学键合相
是正相键合色谱法较常用的固定相。流动相与以硅胶为固定相的吸附色谱法的流动相相似，也是烷烃（常用正已烷等）加适量极性调整剂而构成。氰基键合相的分离选择性与硅胶相似，但极性小于硅胶，即用相同的流动相及其它条件相同时，同一组分的保留时间将小于硅胶。许多需用硅胶柱分离的课题，可用氰基键合相柱完成。氨基键合相与硅胶的性质有较大差异，前者为碱性；后者为酸性。在作正相洗脱时，表现出不同的选择性。氨基键合相色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱，也称为碳水化合物柱。
2. 分离机制
主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力或氢键作用力。例如，用氨基键合相分离极性化合物时，主要靠被分离组分的分子与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离，如对糖类的分离等。若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品，则键合相与组分分子间的作用力，主要是诱导作用力。
3. 流动性的极性与容量因子的关系
在作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱能力增加，K减小，t减小；反之k与t增大。分离结构相近的组分时，极性大的组分后出柱。

反相键合相色谱法
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
(1) 分离机制 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。简要介绍疏溶剂理论。
疏溶剂理论：当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生斥力，自由能（G）增加，熵减小，不稳定性增加。根据热力学第二定律，系统由不稳定到稳定是自发的，即熵增加是自发的。因此，为了弥补熵的损失，溶质分子中非极性部分结构的取向，将导致在极性溶剂中形成一个“容腔”，这种效应称为疏溶剂或疏水效应。该理论认为，在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力，而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。容量因子k与自由能变化△G的关系如下式：
lnk＝lnV/V－△G/RT (8·5)
上式中的R为理想气体常数、T为热力学温度、V是色谱柱中键合相表面所键合的官能团的体积，V是色谱柱中流动相的体积。该式说明△G越大，被分离组分的k越小，保留时间越短。
(2)★★流动相的极性与容量因子的关系 流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，t增大；反之,k与t减小。分离结构相近的组分时，极性大的组分先出柱。
(3) 特点 反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。用反相液相色谱法，可以解决80%左右的液相色谱课题。因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。

㈣ 液相色谱柱子所用的化学键合相填料主要有哪些类型

常见色谱柱中的填料分类

1、液相

a、反相（与离子对）方法
C18（十八烷基或ODS）----------- 普适性好；保留性强，用途广
C8（辛基） -----------与C18相似，但保留值稍小
C3，C4 -----------保留值小；大多用于肽类与蛋白质
C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不稳定
苯基，苯乙基 -----------保留值适中；选择性有所不同
CN（氰基） -----------保留值适中；正相和反相均可使用
NH2（氨基） -----------保留性弱；用于烃类；欠稳定
聚苯乙烯基b -----------在1＜PH＜13的流动相中稳定；对某些分 离峰形好，柱子寿命长

b、正相方法
CN（氰基） -----------普适性好；极性适中；用途广
OH（二醇基） -----------极性大于CN
NH2（氨基） -----------极性大，欠稳定
硅胶b ------------普适性好；价廉；操作欠方便；用于制备LC

c、空间排阻方法
硅胶b -----------普适性极好；作吸附剂用
硅烷化硅胶 -----------吸附性弱，溶剂兼容性好；适用于有机溶剂
OH（二醇基） ------------欠稳定；在水SEC中使用（凝胶过滤）
聚苯乙烯基b ------------广泛用于有机SEC（凝胶渗透）；一般与水和极性大的有机溶剂不相容

d、离子交换方法
键合相 ------------稳定性与重现性均不好
聚苯乙烯基b -------------柱效不高；稳定；重现性好

a ：除另有说明，均为硅胶基质键合相
b ：此类填料为非键合相

㈤ 简述hplc级流动相使用前如何处理

一、基质（担体）

HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。

1．基质的种类

1）硅胶

硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。

硅胶的主要性能参数有：

①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。
③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。

2）氧化铝

具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。

3）聚合物

以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。

所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。

2．基质的选择

硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。

二、化学键合固定相

将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。

1．键合相的性质

目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。

残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的"湿润"性能。

由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同，因此具有相同键合基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大，使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。

2．键合相的种类

化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。

常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。

常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。

另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。

3．固定相的选择

分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。

分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。
另外，美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度，填料的种类和粒度，填料分类也较详细，这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规定填料种类，未规定柱的长度和粒度，这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试剂。
三、流动相

1．流动相的性质要求

一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：

①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。

2．流动相的选择

在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。
正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。

反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显着影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。

在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。

反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：

C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氢呋喃＝0.66C甲醇

C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。

3．流动相的pH值

采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。

4．流动相的脱气

HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。

溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。

除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。

在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。

一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。

5．流动相的滤过

所有溶剂使用前都必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明"已滤过"）。

用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。

6．流动相的贮存

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。

7．卤代有机溶剂应特别注意的问题

卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。

8．HPLC用水

HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。

进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高了）不够灵敏，特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2，测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定。

I类水标准：
NCCLS ASTM
电阻率，MΩ•cm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸盐，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，µm滤器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三档
美国药典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用标准蔗糖溶液1.19 mg/L），电导率在室温pH 6时≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ•cm）。HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典纯水≤10ppm）。

㈥ 什么是化学键合固定相有什么优点

利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相.
优点:①固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多.
②无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命.
③可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析.
④有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集.

㈦ 键合相色谱法的键合相的种类（三种）

非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；
用于反相色谱；
长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。 醚基和二羟基等键合相；
用于反相或正相色谱。 常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶；
一般用于正相色谱 。

㈧ 化学键合相的名词解释

化学键合相所属现代词，指的是采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法。
化学键合相色谱法（CBPC）采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。
以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。