Ⅰ western显影曝光后可以看到蛋白条带，但是背景很深，加入ECL显色液后整张膜都有荧光，用1%BSA室温封闭1h。
不明白你想问什么。
但依你说的这种情况，应该是想求得解决方法吧。只要将ECL显色液稀释后用，黑暗下荧光若隐若现，再压片时间久一点，3min，显出来的片子背景会浅很多，条带应该会相应好看很多
Ⅱ 如何做好ECL发光检测实验
Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、 底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测 实验步骤 。
1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为:
储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2.新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。
3. 用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。
4. 用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。
5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。
6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。
ECL的使用注意事项 ：
1. 发光液不宜暴露于强光下时间过久，请避光保存，在暗室操作。
2. 为了得到最佳的曝光效果，优化一抗、二抗的稀释比例。
3. 请选择高质量保鲜膜。
4. 对于Enlight发光液，应避免使用NaN3 回收HRP 偶联的抗体，因为NaN3 能抑制HRP 的活性。
Ⅲ Western blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很弱怎么办
条带弱的原因可能有以下几个方面：
①.因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，目前国产试剂盒中上海炎熙生物的极敏型ECL试剂盒灵敏度最高了，达到了pg级别，很合适表达不高的蛋白。
②. 蛋白没有充分转移到膜上。
③. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。
④. 曝光时间太短。可适当延长曝光时间。
Ⅳ Western Blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很浓怎么办
如果重新做的话，建议如下：
降低上样量
降低抗体浓度，尤其是二抗
减少曝光时间
如果是已经浓了，想要在目前的片子上再努努力，那只能是看看过一会儿去曝信号是不是能弱点了。其他的洗胶片信号，剥脱银离子的试剂还得单独买，不太现实。如果是机器拍的，就只能过一段时间拍一张，看什么时候淡了，什么时候用了。
Ⅳ western blotting 的过程和原理
什么理论过程？就是原理呗？
WesternBlot原理、显色分类及操作步骤
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：
(一)配胶
1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
2、封胶：
灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)
(二)样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)
(三)电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L
Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L
(四)转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3．转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)
Tween-200.01%~0.02%NaCl150mM
Tween-200.05%
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
(六)发光鉴定
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
三、注意事项：
增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
封闭40~60min
一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
二抗杂交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
发光鉴定。
若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。
一抗溶液中加入0.2%叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）
(七)NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
Ⅵ ECL发光试剂盒AB液混合后就发光正常吗
您要先明白ECL发光液发光原理：一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光。所以AB液混合后发光是正常的，但是发光时间长短和发光液有很大关系，好的发光液比如英格恩公司的EnlithtTM,灵敏度高又不容易淬灭，是蛋白检测实验的一大助力。
Ⅶ western blot时，ecl发光工作液怎么配制
最简单的办法，比比两个瓶子的大小，如果一样大，就是1:1混合，如果大小差异很大，可能是1:40混合的。所以知道要用多少体积的底物，根据比例就能算出来。
但是最保险的办法，还是根据产品说明，或者货号在网上找一下说明书，应该也比较简单的。
Ⅷ 化学发光试剂盒测定结果的验证方法有哪些
将印迹膜置于封闭液中，室温轻轻震荡20-60min，以封闭掉非特异性位点。
弃去封闭液，加入适量的一抗溶液，于摇床上轻轻震荡1h。（也可将印迹膜与一抗在2-8°C条件下孵育过夜。）
将印迹膜于洗脱液中悬浮清洗5min以上，并更换洗脱液4-6次。
4
将印迹膜与适量的HRP-结合物置于摇床上轻轻震荡，室温孵育1h。
5
重复步骤3以去除未结合的HRP-结合物
6
将A液和B液以1：1混合即得到超敏ECL化学发光工作液，推荐使用量为0.1mL/cm2。
7
将工作液与印迹膜于室温孵育5min。
8
将膜从工作液中取出，并用吸水纸吸去多余的液体，置于两层干净的保鲜膜之间，小心挤出印迹膜与保鲜膜之间的气泡。
9
将印迹膜置于暗盒中，蛋白面朝上，于暗室中进行X-光胶片曝光。
10
建议首次曝光时间为60s，进而通过调整曝光时间获得较好的实验结果。
Ⅸ Western-blot实验ECL发光检测实验步骤
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。
1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为:
储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2. 新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。
3. 用镊子将漂洗过的膜取出，将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，轻轻摇晃，室温孵育几十秒到1 分钟。
4. 用镊子将膜夹起5-10 秒，并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液，迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内，去除气泡和褶皱，蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。
5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片，30 分钟或更长时间后全部取出显影。
6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交：用PBST 或TBST 洗涤掉发光液（10min×3 次），然后从开始一抗杂交即可。
Western-blot中ECL发光液的选择很重要，Enlight-Plus检测级别可达pg级，发光时间长，背景低，得到的图像很漂亮，非常有利于实验的进行。
Ⅹ 铁氰酸盐是一种ecl发光试剂吗
超敏ECL化学发光试剂(LumiPico® ECL Reagent)
一、用途：
本试剂是非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-5pg。用X光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持12小时以上的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。特别节省抗体(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。
二、原理：
辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片(放射自显影片)感光记录下来。
三、使用方法：
1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。
2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。
3.蛋白信号显现
1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。
2). 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。
3). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。
4). 于暗室中压上X光片。
5).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。显影冲洗。
6). 调节曝光时间，再次曝光显影。
4、膜的重复使用：
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70?C振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱，最后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封闭。