QPCR的化学方法有哪些

A. QPCR运行过程中仪器和电脑卡住了

可以尝试重启仪器。
如果重启失败可以联系工程师。
即时聚合酶链锁反应（Real-time polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/QPCR/qrt-PCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。
定量即时PCR及定量反转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）已被众多科学家采用，因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。qPCR的发展因为侦测感染病患的病毒或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。
qPCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系。相对于终端PCR方式（end-point PCR，传统的PCR配合凝胶电泳，在反应后侦测）qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。

B. qpcr内参加几行

5行。
qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。
DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

C. 纯生信文章如何用qpcr来验证

纯生信文章用qpcr需要寻找网络中的关键模块来验证。利用Diffcorr包对关键模块中的基因进行差异相关性分析，选择差异相关性较大的基因进行生存分析，并利用RT-qPCR对进行验证，从而确定肺腺癌中的关键基因。

qpcr的概括

QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称定量即时PCR、即时定量PCR，是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应循环后产物总量的方法。

qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。

D. qpcr原理及应用是什么

一、原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；

重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

二、应用

1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。

2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。

整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。

2、检验生物芯片的结果；

3、siRNA与miRNA诊断；

4、基因型鉴定；

5、饮食分析；

6、兽医微生物检测。

特点

1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；

其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。

2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。

如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

E. qpcr条件怎么调

qpcr条件需要根据引物和目的基因的长度进行调整，根据qpcr引物设计原则，引物的Tm值在60℃左右，因此这一步的温度一般可设为60℃。 时间还需根据仪器使用要求进行设置，如ABI StepOne、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要设置30s，而ABI 7500则至少需要设置34s。
qpcr拓展知识: Quantitative Real-time PCR,中文名是 实时荧光定量PCR。 qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

F. 简述RT-qPCR的原理,简要说明其操作步骤及在临床科研中的应用

摘要 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用0ligo (dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使测的灵敏性提高了几个数量级，使- - 些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

G. qpcr原理及应用

qpcr原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流。

应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

(7)QPCR的化学方法有哪些扩展阅读

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

H. qPCR引物的纯化方式

用HPLC纯化方法。
由于qpcr属于定量分析，必须要求引物纯度高。所以必须用HPLC纯化。
一般情况下,选择PAGE,或者iPAGE(也叫TON)纯化,这种纯化方式的引物基本可以满足常规分子生物学试验,包括：PCR,qPCR,克隆扩增等等.价格还算亲民,便宜.TON是最便宜的,所以也推荐这种方式.还有一种方式是HPLC.
使用于qPCR侦测的化学物基本可分为两类：非专一性化学物通常是与DNA结合的萤光染剂；目标专一性化学物是使用萤光探针或引子。
非专一性侦测：SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)
目标专一性侦测：TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)。

I. 请问什么叫QPCR

QPCR 问：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：第一代产品：基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。第二代产品：基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。第三代产品：实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？答：QPCR至少有以下特点：所用仪器少，只用一台仪器。检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化，如图一所示： 图一 西安天隆TL988实际曲线1检测动态范围：10～10000000000 DNA copies/ml检测精度：0.1RLU辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7％。问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，沙眼衣原体，Neiserria gonorrhea(NG)，性传播疾病，淋病双球菌，Cytomegalovirus（CMV），性传播疾病，巨细胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，结核分支杆菌等。实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如美国ABI/7700-120万元，美国ABI/5700-50万元，瑞士Roche/Lightcycler-70万元，美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元 可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。 国产仪器情况：国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪（48孔） 以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在45万以上。 国产试剂情况：多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV，优生优育系列：巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。 编辑词条 开放分类：病毒、DNA、PCR、分子生物、实时荧光定量PCR仪 参考资料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 贡献者：zhang120jing、弦之月NONO

J. 如何作QPCR的标准曲线

作QPCR的标准曲线可以用PCR－ELISA法作。

具体如下：

PCR－ELISA法：

利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合；

再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。

常规的PCR－ELISA法只是定性实验，加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，从而得到该性质的数值所组成的曲线。

(10)QPCR的化学方法有哪些扩展阅读：

实时荧光定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法：

1、SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。

而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图、PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）。

2、TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。