① 高效液相层析法的主要类型
⑴ 液-固吸附层析:固定相是具有吸附活性的吸附剂,常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同,分为 “底剂”和洗脱剂两类,底剂起决定基本色谱的分离作用,洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短,并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择,直接影响色谱的分离情况,一般底剂为极性较低的溶剂,如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等,洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂,如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。
⑵ 液-液分配层析:固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上,经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。化学键合层析分:①极性键合相层析:固定相为极性基团,氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰,极性大的后出峰,这称为正相层析法,适用于分离极性化合物。②非极性键合相层析:固定相为非极性基团,如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基与苯基等,流动相用强极性溶剂,如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂,水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基,防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰,极性小的组份后出峰,恰好与正相法相反,故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离,如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。离子对分配层析分:①正相离子对层析:此法常以水吸附在硅胶上作为固定相,把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中,待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对,在水相和有机相中进行分配,而达到分离。本法优点是流动相选择余地大,缺点是固定相易流失。②反向离子对层析:固定相是疏水性键合硅胶,如C18键合相,待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中,生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配,而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。
⑶ 离子交换层析:原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中,固定相多用离子性键合相,故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液,pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。
② 什么是正相键合相色谱法什么是反相键合相色谱法
正相键合相色谱法
1. 氰基与氨基化学键合相
是正相键合色谱法较常用的固定相。流动相与以硅胶为固定相的吸附色谱法的流动相相似,也是烷烃(常用正已烷等)加适量极性调整剂而构成。氰基键合相的分离选择性与硅胶相似,但极性小于硅胶,即用相同的流动相及其它条件相同时,同一组分的保留时间将小于硅胶。许多需用硅胶柱分离的课题,可用氰基键合相柱完成。氨基键合相与硅胶的性质有较大差异,前者为碱性;后者为酸性。在作正相洗脱时,表现出不同的选择性。氨基键合相色谱柱是分析糖类最重要的色谱柱,也称为碳水化合物柱。
2. 分离机制
主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力或氢键作用力。例如,用氨基键合相分离极性化合物时,主要靠被分离组分的分子与键合相的氢键作用力的强弱差别而分离,如对糖类的分离等。若分离含有芳环等可诱导极化的非极性样品,则键合相与组分分子间的作用力,主要是诱导作用力。
3. 流动性的极性与容量因子的关系
在作正相洗脱时,流动相的极性增大,洗脱能力增加,K减小,t减小;反之k与t增大。分离结构相近的组分时,极性大的组分后出柱。
反相键合相色谱法
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相,常用十八烷基(ODS或C)键合相;流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统,用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
(1) 分离机制 反相键合相表面具有非极性烷基官能团,及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能,剩余硅醇基的多寡,视覆盖率而定。简要介绍疏溶剂理论。
疏溶剂理论:当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时,相互产生斥力,自由能(G)增加,熵减小,不稳定性增加。根据热力学第二定律,系统由不稳定到稳定是自发的,即熵增加是自发的。因此,为了弥补熵的损失,溶质分子中非极性部分结构的取向,将导致在极性溶剂中形成一个“容腔”,这种效应称为疏溶剂或疏水效应。该理论认为,在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力,而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力,促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合,且缔合反应是可逆的。容量因子k与自由能变化△G的关系如下式:
lnk=lnV/V-△G/RT (8·5)
上式中的R为理想气体常数、T为热力学温度、V是色谱柱中键合相表面所键合的官能团的体积,V是色谱柱中流动相的体积。该式说明△G越大,被分离组分的k越小,保留时间越短。
(2)★★流动相的极性与容量因子的关系 流动相的极性增大,洗脱能力降低,溶质的k增大,t增大;反之,k与t减小。分离结构相近的组分时,极性大的组分先出柱。
(3) 特点 反相色谱法是应用最广的色谱法,主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物,因为键合相表面的官能团不流失,溶剂的极性可以在很大范围内调整,因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法,可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。用反相液相色谱法,可以解决80%左右的液相色谱课题。因此,必须给予反相色谱法足够的重视。对于结构异构体等难分离物质的分离,则应选用吸附色谱法。
③ 高效液相色谱法的原理与适用范围及采样要求
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9´107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。
特点
1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~350×105Pa。
2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于 1h 。
3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。
4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。
5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ~ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种主要类型:
1 .液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达到平衡时,服从于下式:
式中,cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度; Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
c. 液 — 液分配色谱法的缺点:尽管流动相与固定相的极性要求完全不同,但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力,会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后),可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。
2 .液 — 固色谱法
流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可表示如下:
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中:Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时:
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中:K为吸附平衡常数。[讨论:K越大,保留值越大。]
3 .离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例,其交换过程可表示如下:
X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)
当交换达平衡时:
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系数为:
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[讨论:DX与保留值的关系]
凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)
离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示:
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相
式中:X+水相--流动相中待分离的有机离子(也可是阳离子);Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对(如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等);X+Y---形成的离子对化合物。
当达平衡时:
KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相
根据定义,分配系数为:
DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[讨论:DX与保留值的关系]
离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非离子混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
5 .离子色谱法(Ion Chromatography)
用离子交换树脂为固定相,电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器,为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰,设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相,分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时,发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的逆过程):
抑制柱上发生的反应:
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可见,通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水,消除了本底电导的影响;试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-,可用电导法灵敏的检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
6 .空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)
空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。
高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、.分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。
1.进样系统
一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
2.输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。
3.分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。
再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。
4.检测系统
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。
(1)紫外检测器
该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点:使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。
(2)示差折光检测器
凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml),流动相的变化会引起折光率的变化,因此,它既不适用于痕量分析,也不适用于梯度洗脱样品的检测。
(3)荧光检测器
凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此,这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。
(5)数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
④ 常用的化学键合相有哪几种类型 分别用于哪些液相色谱法中
C18,C8,硅胶柱,氨基柱,氰基柱等。
⑤ 液相色谱柱子所用的化学键合相填料主要有哪些类型
常见色谱柱中的填料分类
1、液相
a、反相(与离子对)方法
C18(十八烷基或ODS)----------- 普适性好;保留性强,用途广
C8(辛基) -----------与C18相似,但保留值稍小
C3,C4 -----------保留值小;大多用于肽类与蛋白质
C1【三甲基硅烷(TMS)】------保留值最小;最不稳定
苯基,苯乙基 -----------保留值适中;选择性有所不同
CN(氰基) -----------保留值适中;正相和反相均可使用
NH2(氨基) -----------保留性弱;用于烃类;欠稳定
聚苯乙烯基b -----------在1<PH<13的流动相中稳定;对某些分 离峰形好,柱子寿命长
b、正相方法
CN(氰基) -----------普适性好;极性适中;用途广
OH(二醇基) -----------极性大于CN
NH2(氨基) -----------极性大,欠稳定
硅胶b ------------普适性好;价廉;操作欠方便;用于制备LC
c、空间排阻方法
硅胶b -----------普适性极好;作吸附剂用
硅烷化硅胶 -----------吸附性弱,溶剂兼容性好;适用于有机溶剂
OH(二醇基) ------------欠稳定;在水SEC中使用(凝胶过滤)
聚苯乙烯基b ------------广泛用于有机SEC(凝胶渗透);一般与水和极性大的有机溶剂不相容
d、离子交换方法
键合相 ------------稳定性与重现性均不好
聚苯乙烯基b -------------柱效不高;稳定;重现性好
a :除另有说明,均为硅胶基质键合相
b :此类填料为非键合相
⑥ 液相色谱法有几种类型
1、液固吸附色谱
高效液相色谱中的一种,是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
2、液液分配色谱法
基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异,通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同,分为正相色谱和反相色谱。
前者是用硅胶或极性键合相为固定相,非极性溶剂为流动相;后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相,极性溶剂为流动相,适用于非极性化合物的分离。
3、离子交换色谱法
基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。薄壳型离子交换树脂柱效高,主要用来分离简单的混合物;多孔性树脂进样容量大,主要用来分离复杂混合物。
4、凝胶渗透色谱法
又称为尺寸排阻色谱法。以溶剂为流动相,多孔填料(如多孔硅胶、多孔玻璃)或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后,流经多孔凝胶时,体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过,较早地被冲洗出柱外;
而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去,较晚地被冲洗出来,混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。
5、离子色谱法
采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法,样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式,离子色谱可以分为高效离子色谱 、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂,分离机理主要是离子交换。
离子排斥色谱法用高容量的树脂,分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂,分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。
6、离子对色谱法
离子对色谱法是将一种(或数种)与样品离子电荷(A+)相反的离子(B-,称为对离子或反离子,加入到色谱系统的流动相(或固定相)中,使其与样品离子结合生成弱极性的离子对(呈中性缔合物)。此离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中,从而控制溶质离子的保留行为。
液相色谱法的优点和应用
1、优点
离子色谱法具有快速、灵敏、选择性好和同时测定多组分的优点。尤其对于阴离子的测定,离子色谱的出现是分析化学中的一项突破性的新进展。
2、应用
离子色谱法主要用于测定各种离子含量,广泛应用于水、纸浆和漂白液、食品分析、生物体液、钢铁和环境分析等各个领域。
⑦ 高效液相色谱法的主要类型有哪些
高效液相色谱法分为:液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1、液-固色谱法(液-固吸附色谱法)
固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制
吸附剂:一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应:
X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为:
K值较小:溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。 K值较大:表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相
常用的液-固色谱吸附剂:薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律:对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。
对流动相的基本要求: 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小
流动相不能影响试样的检测
常用的流动相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用
常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2、液-液色谱法(液-液分配色谱法)
将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。
液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:K=C固/C液 K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。
②正相色谱和反相色谱
正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。
一般地,正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性,而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物,反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。
③液-液色谱法的固定相 常用的固定液为有机液体,如极性的β,β′氧二丙腈(ODPN),非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。
缺点:涂渍固定液容易被流动相冲掉。 采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键,例如在硅胶表面利用硅烷化反应:形成Si-O-Si-C型键,把固定液的分子结合到担体表面上。
优点:
化学键合固定相无液坑,液层薄,传质速度快,无固定液的流失。 固定液上可以结合不同的官能团,改善分离效能。 固定液不会溶于流动相,有利于进行梯度洗提。
④液-液色谱法的应用
液-液色谱法既能分离极性化合物,又能分离非极性化合物,如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同,或化合物的相对分子质量不同,均可以用液-液色谱进行分离。
3、离子交换色谱法
原理:离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换,由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力(作用力)而被分离。
①离子交换色谱法的作用机制
聚合物的分子骨架上连接着活性基团,如:-SO3-,-N(CH3)3+等。为了保持离子交换树脂的电中性,活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X,称为反离子。
②溶剂和固定相
两种类型:多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂:极小的球型离子交换树脂,能分离复杂样品,进样量较大;缺点是机械强度不高,不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂:在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂,这种树脂柱效高,当流动相成分发生变化时,不会膨胀或压缩;缺点是但柱子容量小,进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物,凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。
广泛地应用于:无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。 4.凝肤色谱法(空间排阻色谱法)
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体,表面布满孔隙,能被流动相浸润,吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子,由于不能进入孔隙而被排阻,直接从表面流过,先流出色谱柱;小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻,然后又从孔隙中出来随载液流动,后流出色谱柱;中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中,但受到较小孔隙的排阻,介乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数,适宜于分离相对分子质量大的化合物,相对分子质量在400~8×105的任何类型的化合物。
保留时间短,色谱峰窄,容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱,趁于零,柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物,分子量相差需在10%以上时才能得到分离。
⑧ 化学键合相可以作为高效液相色谱柱的填料对还是错
化学键合相可以作为高效液相色谱柱的填料是对的, 化学键合相 即 化学键合固定相。化学键合固定相一般都采用硅胶(薄壳型或多全孔微粒型)为基体。在键合反应之前,要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理,然后再使用硅胶表面上的硅羟基与各种有机型硅化合物起反应,制备化学键合固定相。
⑨ 化学键合相的名词解释
化学键合相所属现代词,指的是采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法。
化学键合相色谱法(CBPC)采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法,简称键合相色谱。
以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。