如何用物理方法分离循环的肿瘤细胞

‘壹’ 细胞分离

体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。

体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。

细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。

发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、设计不同的培养液等几个方面进行。

1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织；

1903年Jolly，1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养；

1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法；
1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法；
1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法；
1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。

Earle等加以改进，使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上，培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。

组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。

在培养容器方面, 由简单的用试管、旋转管培养，发展到多种培养瓶培养，近年来，塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。

在培养基方面，从50年代初，Parke、Eagle等设计出合成培养基后，从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清（促细胞生长物），直至60年代设计出无血清培养基。

首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液，以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。

在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。
1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。
1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。
从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。
诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。

在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。

在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liang等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。

细胞分离就是通过物理、生物、化学的方法，将生物组织分离为单细胞分散系的过程。
一般动物组织经培养，其细胞会延培养基表面平铺生长，自行达到细胞分离的目的。还可用胶原酶处理分离。
而植物组织培养后会形成愈伤组织，要用化学方法才能获得单个细胞（一般用纤维素酶）。

‘贰’ 如何破坏肿瘤细胞的细胞膜，在不改变其他结构和胞内酶活性的情况下

在一定的PH环境和一定温度内，先保持胞内酶的活性，在对肿瘤细胞的细胞膜进行分析，了解其结构，并用相应的抗体或酶对细胞膜进行溶解。

‘叁’ 肿瘤细胞与树突状细胞共培养，怎样将两者分开

肿瘤细胞与树突状细胞共培养，可以用免疫磁珠，过柱分离。或者荧光，流式分选

‘肆’ 将骨癌患者的骨头取出来，高温杀死癌细胞再移植回去，这种方法靠谱吗

将骨癌患者的骨头取出来，高温杀死癌细胞再移植回去，这种方法靠谱吗？

大家好，在网络上有这么一篇文章，就是关于骨肿瘤的一个治疗方法，就是说将这个患者的患有骨肿瘤的部位的这个骨头取出来，高温煮死癌细胞之后再放回去，那很多人对这个话题，还是头一次听说，那这种方法到底靠谱吗？有没有什么科学依据呢？

第三，总之骨肿瘤切除术之后，再进行重建，也有很多的方法，而且每一种方法他都有自己的优缺点，而且在实际生活中，具体采取何种方法来进行治疗，这个是需要根据病人的病情以及病人的意愿，还有家庭的经济情况来决定的。

好，以上便是本文章的全部内容，我们下期再见。

‘伍’ 癌细胞是怎么进行转移和扩散的都有哪些症状

我们身体里面有非常多的淋巴管和淋巴组织。淋巴组织属于免疫系统，本来是可以消灭肿瘤的，但是，肿瘤细胞通过各种途径逃避了免疫细胞的打击。

甚至让免疫细胞作为癌症的帮凶，帮助他们转移。癌细胞通过淋巴管道，可以转移到附近的淋巴结，甚至远处的淋巴结。

癌细胞长到一定程度，可以脱落，进入到癌症周围的血管之中，然后随着血流进入全身的各个组织和器官，所以，血供丰富的器官，容易被转移。例如肝转移，肺转移，脑转移和骨转移。

常见的乳腺癌就比较容易引起骨转移，癌细胞转移到骨上后会破坏骨质，产生骨痛，严重的可以导致骨折，比较容易转移到脊柱骨。而脊柱骨骨破坏严重产生的骨折则可以引起截瘫等严重并发症。

癌转移到不同位置会出现相应症状，转移到大脑可以引起神经精神症状。当然癌症一般伴随消瘦、乏力等常规表现。对于辅助诊断和判断患者预后也有一定的帮助。

‘陆’ 循环肿瘤细胞如何培养

一、首先是富集，分离，筛选出循环肿瘤细胞。
由于CTCs在外周血中的数量极少, 通常需在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中寻找仅有的数
个肿瘤细胞[1], 因此为了提高CTCs的检出率, 通常需在检测前行CTCs富集. 目前CTCs的富集方
法按其原理主要分为免疫磁性分离法和基于形态学的富集法。
免疫磁性分离法(immunomagnetic separation,IMS) IMS的原理是基于肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合, 继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠相连被吸附而滞留在磁场中, 无该种表面抗原的其他细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性, 不在磁场中停留, 从而使肿瘤细胞得以分离。
密度梯度离心法是目前实验室常用的一种基于形态学特点富集肿瘤细胞的方法, 可从外周血中分离单个核细胞(包括CTCs), 设备要求不高, 方法较为简单, 但该方法缺乏特异性, 易导致缺乏相应密度的
肿瘤细胞丢失。
二、培养
直接培养往往增殖数量有限，甚至在细胞株化前可能死亡而无法长期培养。
可以通过导入腺病毒载体的方法来实现不死化。

‘柒’ 物理疗法包括哪些内容

1、人工疗法

酒精擦浴等。

2、电疗法

包括静电疗法、直流电疗法、低频电疗法、中频电疗法、高频电疗法、超高频电疗法、特高频电疗法、离子导入疗法、电离空气疗法、电水浴疗法、射频疗法、经颅微电流刺激疗法等。

3、磁疗法

包括静磁场疗法、脉动磁场疗法、低频磁场疗法、中频电磁场疗法、高频电磁场疗法等。

4、光疗法

包括红外线疗法、可见光疗法、紫外线疗法、激光疗法等。

此外，还有超声波疗法、水疗法、传导热疗法、冷冻疗法、运动疗法、拔罐疗法、电子生物反馈疗法等。

5、自然疗法

包括矿泉、气候、空气、日光、海水疗法等。

6、力学疗法

就是运动或者其它的方式来治疗某些问题，如斜面护脊床垫的矫正脊柱的方法就属于这种力学疗法。

(7)如何用物理方法分离循环的肿瘤细胞扩展阅读：

物理疗法的作用：

（1）消炎作用，理疗都可促进炎症的吸收消散，按炎症的性质，可分别选用各种疗法。

（2）镇痛作用，主要对神经、关节、肌肉疼痛以及内脏的痉挛性疼痛。

（4）兴奋作用，主要用于神经麻痹、肌肉萎缩、局部感觉障碍等。

（5）缓解痉挛作用。

（6）松解粘连、软化瘢痕。

此外，有脱敏、杀菌、治癌、解热及发汗作用等。

‘捌’ 物理疗法和化学疗法

化学疗法就是利用能治疗疾病，但不导致病人死亡的化学物质治疗某种疾病。保罗·恩利希最先使用了这个名词，他是一所研究感染性疾病和血清研究所的所长。
在利物浦，己有人试着用一种合成的砷化合物来治疗寄生虫的感染。但当恩利希试图重复这些结果时，他发现疾病产生了对这种药物的耐药性。他要求化学家试着合成许多不同的砷化合物。
图：一个18岁的病人因癌症化疗后头发脱落。
后来，另一位德国科学家弗里茨·绍丁在1905年发现了引起梅毒（一种经性传播的疾病）的微生物。恩利希就用他的化合物来试验对这种新微生物的治疗作用。他高兴地发现，606号化合物有效果。他把这种化合物称为洒尔氟散，并戏称它为“神奇的子弹”，因为它对梅毒有特效。1911年，它第一次运用于梅毒的治疗。
从那以后，科学家们一直在寻找能杀伤肿瘤细胞、不对人体造成严重伤害的化学物质。在发现有效的化学物质之前，科学家得对几千种化学物质进行测试。
许多种癌症现在能被治愈。干扰素是人体针对某些病毒发生反应后而自然产生的蛋白质。它们刺激人体自身的防御系统，杀伤一些癌症细胞。它们已经被成功地用于治疗某些类型的白血病，并能延缓一些肿瘤的发展。
化学疗法是将药物经血管带到全身，对身体所有细胞都有影响。这种疗法有时也称为“胞毒疗法”，因为所用药物都是有害，甚至是带毒性的，体内细胞，无论是否恶性细胞，都受到破坏。
化学治疗的临床应用有四种方式
1．晚期或播散性肿瘤的全身化疗
因对这类肿瘤患者通常缺乏其它有效的治疗方法，常常一开始就采用化学治疗，近期的目的是取得缓解。通常人们将这种化疗称为诱导化疗(Inction Chemotherapy)。如开始采用的化疗方案失败，改用其它方案化疗时，称为解救治疗(Salvage Treatment)。
2．辅助化疗(Adjuvant Chemotherapy)
是指局部治疗(手术或放疗)后，针对可能存在的微小转移病灶，防止其复发转移而进行的化疗。例如骨肉瘤、睾丸肿瘤和高危的乳腺癌病人术后辅助化疗可明显改善疗效，提高生存率或无病生存率。
3．新辅助化疗(Neoadjuvant Chemotherapy)
针对临床上相对较为局限性的肿瘤，但手术切除或放射治疗有一定难度的，可在手术或放射治疗前先使用化疗。其目的是希望化疗后肿瘤缩小，从而减少切除的范围，缩小手术造成的伤残；其次化疗可抑制或消灭可能存在的微小转移，提高患者的生存率。现已证明新辅助化疗对膀胱癌、乳腺癌、喉癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、非小细胞肺癌、食管癌及头颈部癌可以减小手术范围，或把不能手术切除的肿瘤经化疗后变成可切除的肿瘤。
4．特殊途径化疗
(1)腔内治疗 包括癌性胸腔内、腹腔内及心包腔内积液。通常将化疗药物(如丝裂霉素、顺铂、5-氟脲嘧啶、博来霉素)用适量的流体溶解或稀释后，经引流的导管注入各种病变的体腔内，从而达到控制恶性体腔积液的目的。
(2)椎管内化疗 白血病及许多实体瘤可以侵犯中枢神经系统，尤其是脑膜最容易受侵。治疗方法是，通常采用胸椎穿刺鞘内给药，以便脑积液内有较高的药物浓度，从而达到治疗目的。椎管内常用的药物有甲氨喋呤及阿糖胞苷。
(3)动脉插管化疗 如颈外动脉分枝插管治疗头颈癌，肝动脉插管治疗原发性肝癌或肝转移癌。
合理用药原则
尽管目前已有40余种常用的抗肿瘤药物，而且新药还在不断地发展，但欲取得好的疗效，还必须有合理的治疗方案，包括用药时机、药物的选择与配伍、给药的先后次序、剂量、疗程及间隔时间等，才能做到全面、合理、有效地选择联合化疗方案。通常联合化疗方案的组成要考虑以下原则：
1．使用不同作用机制的药物，以便发挥协同作用；
2．药物不应有相似的毒性，以免毒性相加，患者不能耐受；
3．单一用药必须有效。
化疗注意事项
(1) 开始治疗前诊断必须明确，白血病、多发性骨髓瘤与恶性组织细胞瘤必须得到血液学和骨髓细胞学诊断。恶性淋巴瘤与其它各种实体瘤必须得到局部组织的病理诊断，化疗药物一般不用于诊断性治疗，更不能作为安慰剂使用，以免给病人造成不必要的损失。
(2) 患者一般情况较好，血象及肝、肾功能正常，才能耐受化疗。凡有下列情况之一者，应慎重考虑药物的种类与剂量：[1] 年老体弱；[2] 以往经过多种化疗或与放疗同时进行；[3] 肝、肾功能异常；[4] 明显贫血；[5] 白细胞或血小板低于正常值；[6]营养不良、血浆蛋白明显减少；[7] 肿瘤骨髓转移；[8] 肾上腺皮质功能不全；[9] 有发热、感染或其它并发症；[10] 心肌病变等；[11] 慢性肺功能不全。
化疗失败的原因
1．病人方面
骨髓与其它重要器官(肝、肾、心、肺等)的功能不全，患者的一般情况太差，不能耐受化疗。
2．肿瘤方面
原发或继发性抗药；增殖比率较低处于静止期细胞多；肿瘤的负荷过大，瘤细胞在1011 以上。
3．药物方面
选择性不强，对肿瘤和正常组织细胞的损伤差别不大；对GO期细胞无效或效力太差；不能作用于“避难所”内的瘤细胞如不能通过血脑屏障而进入颅内；最有效的使用方法尚未找到。
基本概述
应用各种物理因素作用于人体，以防治疾病的方法，称为物理疗法，简称理疗。
物理疗法有悠久的历史，特别是70年代以来，扩大了理疗的适应证，提高了理疗效果。随着现代物理学的发展，更有效的物理疗法，将不断充实到理疗学科中来。
[编辑本段]主要种类
1.人工物理因素疗法
（1）电疗法
包括静电疗法、直流电疗法、低频电疗法、中频电疗法、高频电疗法、超高频电疗法、特高频电疗法、离子导入疗法、电离空气疗法、电水浴疗法、射频疗法、经颅微电流刺激疗法等。
（2）磁疗法
包括静磁场疗法、脉动磁场疗法、低频磁场疗法、中频电磁场疗法、高频电磁场疗法等。
（3）光疗法
包括红外线疗法、可见光疗法、紫外线疗法、激光疗法等。
此外，还有超声波疗法、水疗法、传导热疗法、冷冻疗法、运动疗法、拔罐疗法、电子生物反馈疗法等。
2.自然物理因素的疗法
包括矿泉、气候、空气、日光、海水疗法等。
[编辑本段]主要作用
1.共同性作用和特殊性作用
（1）共同性作用：如充血、消炎、镇痛等。
（2）特殊性作用：如低频电流引起肌肉收缩；紫外线促进维生素D的形成；直流电流的电解、电泳，能将药物离子导入体内；超声波的振荡雾化；高频电可使组织内部产生“内生热”等。
2.直接作用和反射作用
（1）直接作用：如高能量激光治疗疣、胎痣、血管瘤；紫外线刺激皮肤细胞和杀菌；直流电场内的离子移动；超高频电场促使偶极分子振荡以及电解拔毛等。
（2）反射作用：是间接作用，是理疗的主要作用机制，是不同于其他疗法的主要特点，是借机体的反射作用和防御性反应，来保持和恢复生理平衡，从而消除病理过程。
[编辑本段]应用范围
1.预防
许多种物理因素应用于健康人，可以增强抵抗力，预防某些疾病。
2.治疗
（1）消炎作用，理疗都可促进炎症的吸收消散，按炎症的性质，可分别选用各种疗法。
（2）镇痛作用，主要对神经、关节、肌肉疼痛以及内脏的痉挛性疼痛。
（4）兴奋作用，主要用于神经麻痹、肌肉萎缩、局部感觉障碍等。
（5）缓解痉挛作用。
（6）松解粘连、软化瘢痕。
此外，有脱敏、杀菌、治癌、解热及发汗作用等。
3.康复
物理疗法在病后恢复和伤残者功能重建中，具有重要的实用价值。在病后，物理因素可以增进食欲，促进体力恢复，如紫外线疗法、水疗法、温泉疗法、日光浴疗法等。对伤残者功能恢复，如电疗、光疗、水疗、体育疗法均可广泛应用，能提高劳动能力和降低残废率。
[编辑本段]注意事项
1.理疗方法的综合应用
（1）复合疗法：即同时在同一患者或同一部位，进行2种以上的方法。
（2）联合疗法：先后连续应用2种以上的理疗方法。
（3）交替联合疗法：是两疗法间隔时间较长的联合作用，也即是交替应用。
2种以上理疗方法之目的是利用物理因素的协同或相加作用以增强疗效。
2.加剧反应的发生和处理
在某些理疗过程中，出现症状、体征恶化现象。这种加剧反应一般不需特殊处理，多在理疗进行中自然消退。局部加剧反应如持续l周以上，或症状进一步加重，则宜减少剂量，延长时间，或停止理疗。全身加剧反应时应停止数日，从小剂量开始或更换其他理疗方法。
3.适应和禁忌
（1）适应
应选择适当的理疗方法，针对治疗某种病证，理疗适用范围包括各种炎症、神经系统疾病、心血管系疾病、骨伤科疾病等。
（2）禁忌
严重的心脏病、动脉硬化、有出血倾向、恶病质及可刺激肿瘤细胞生长的物理因素，均属禁用范围。

‘玖’ 实验室培养的肿瘤细胞和从人体分离出的原代肿瘤细胞有什么区别

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培 养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

操作步骤
（一）胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带 入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如 胶原酶，透明质酶等）。

‘拾’ 培养人肿瘤细胞，剩余的肿瘤细胞该怎样处理（化学或物理灭活）之后才能予以丢弃还有巴氏滴管什么的。

这种用过的物品最好是用紫外照射30min后，再用稀释的84消毒液进行处理。不过我们那一般做病毒的非常严格，癌细胞好一点。

希望能够帮到你~有问题一起讨论解决哦~